笹井芳樹不僅僅是一位普通的組織工程師，他嘗試誘導幹細胞生長成完全成形的身體結構。的確，笹井透過承擔重大專案而名聲大噪，例如利用幹細胞培養視網膜、皮質組織和小腦，這些都與平衡和運動有關。但是，他的研究更深入地探討了幹細胞如何在基因和產前環境的影響下組織成複雜的結構。請閱讀此處對笹井的個人簡介，以配合《大眾科學》11月刊中笹井自己撰寫的關於培養視網膜的文章“自己培養眼睛”。
來自《自然》雜誌
2010年12月，羅賓·阿里突然對一項通常很平凡的科學論文評審工作感到興奮。“我當時在房間裡跑來跑去，揮舞著手稿，”他回憶道。這篇論文描述了一團胚胎幹細胞如何生長成一個圓形的視網膜組織杯狀體。這種被稱為視杯的結構在發育中的胚胎中形成眼睛的後部。但是這個視杯是在培養皿中形成的，而且論文附帶的影片顯示該結構正在緩慢地萌發和綻放。對於在倫敦大學學院工作並致力於修復視力的眼科醫生阿里來說，其意義是顯而易見的。“對我來說，這顯然是一篇里程碑式的論文，”他說。“他改變了這個領域。”
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“他”是笹井芳樹，日本神戶理化學研究所發育生物學中心的幹細胞生物學家。笹井以其誘導神經幹細胞生長成複雜結構的“園藝”天賦給許多研究人員留下了深刻的印象。除了視杯1，他還培養了大腦皮層的精細組織層2和一個基本的、產生激素的垂體3。他現在正在培養小腦4，小腦是協調運動和平衡的大腦結構。“這些論文是近年來最令人著迷的幹細胞論文系列，”布魯塞爾自由大學的幹細胞科學家盧克·萊恩斯說。
笹井的工作不僅僅是組織工程：它解決了困擾發育生物學家數十年的問題。胚胎中不斷增殖的幹細胞是如何無縫地組織成身體和大腦的複雜結構的？組織形成是由細胞固有的遺傳程式驅動的，還是由鄰近組織的外部線索塑造的？透過將直覺與耐心的嘗試結合起來，笹井發現這需要兩者之間的微妙平衡：他構建了可控制的環境，為細胞提供物理和化學訊號，但也讓它們自由地“做自己的事”，並將自己組織成組織。他有時把自己比作一位日本媒人，他知道，把兩個陌生人帶到一起後，就需要讓他們獨處。“他們知道該怎麼做，”他說。“它們以微妙的方式相互作用，如果外部線索太強，就會覆蓋內部線索。”
笹井的工作可能會找到醫學應用。事實證明，以三維形式再現胚胎髮育，可以比二維培養更豐富、更有效地產生臨床上有用的細胞，例如光感受器，並將其安置在與人體結構相對應的結構中。笹井和他的合作者現在正在競相將實驗室培養的視網膜植入小鼠、猴子和人體內。在笹井看來，在二維培養中成熟的幹細胞可能會導致“下一代”療法，但他的方法將導致“下下一代”療法。
自我決定
笹井的動作有些僵硬，舉止也比較保守，但他仍然在國際研討會後他所在的研究所舉辦的派對上用雞尾酒調酒器進行戲劇性的表演。“我的第二份工作是調酒師，”他面無表情地說。然而，正是他在96孔培養板中調製的雞尾酒為他贏得了科學界的讚譽。
像他的許多家人一樣，笹井也學習了醫學。但他很快對該領域缺乏基礎知識感到沮喪，尤其是在神經系統疾病方面。“不瞭解大腦，醫生就無法為患者做太多事情，治療方法也永遠是膚淺的，”他回憶起當時的思考。似乎沒有比研究大腦在胚胎中如何出現和摺疊更好的方法來了解大腦了。“它很複雜，通常複雜的系統都是混亂的，”笹井說。“但它是最有秩序的系統之一。”他想知道這個精細的系統是如何被控制的。
謎題的一部分是眾所周知的：斯佩曼組織者，脊椎動物胚胎中的一個節點，它誘導周圍的細胞變成神經組織。自1924年被發現以來，該組織者是如何工作的仍然是一個謎；為了弄清楚這一點，笹井接受了在加州大學洛杉磯分校的博士後職位。當笹井在前往加州的途中在機場被搶走錢和護照時，這個職位的開端很艱難。但他的科學努力很快得到了回報。“他補辦了護照，並在一個月內克隆出了使我們獲得著名的chordin基因的基因，”他的主管，發育生物學家埃迪·德·羅伯蒂斯說。
笹井和他的同事發現，chordin蛋白是斯佩曼組織者釋放的關鍵發育訊號5。他們發現，chordin不是推動附近的細胞變成神經元，而是阻止那些將它們變成其他細胞型別的訊號6,7。這項工作有助於建立神經誘導的預設模型：即在沒有其他訊號的情況下，胚胎細胞將遵循內部程式成為神經細胞的觀點。
到20世紀90年代末，胚胎幹細胞科學家也在研究這些訊號。他們想把幹細胞變成成熟的細胞型別——特別是神經元——這可能會導致療法。笹井說，問題在於科學家通常“用力過猛，擾亂了系統”。笹井知道，在胚胎中，從系統中減去訊號才是關鍵，而不是擾亂它。“我們試圖最大限度地減少外部線索，”他說。
笹井圍繞這一理念建立了一個實驗系統。他拋棄了通常新增到生長中的胚胎幹細胞中的血清，其中包含各種未經表徵的生長因子和其他訊號分子。他還去除了物理線索，例如與培養皿塑膠表面的接觸，允許胚胎幹細胞自發形成漂浮的聚集體，稱為胚狀體。“如果它們被附著，它們就像囚犯一樣，無法表達自己的意願，”他說。在沒有這些支援系統的情況下讓細胞存活下來是一個挑戰，但是經過五年仔細的實驗後，笹井發表8並隨後獲得了他的無血清胚狀體培養的專利——一個精簡的生命支援系統，其中只包含恰到好處的成分混合物，供細胞存活。這將成為他的腦組織工廠的核心。
量身定製
在笹井的系統中，胚狀體很快變成了他所謂的“腦球”——其中充滿了神經前體細胞。笹井發現，完全不加干預的腦球會產生類似於發育中的大腦區域（稱為下丘腦）中的細胞9，但那些只添加了一點生長因子的腦球開始分化成大腦皮層細胞2。當笹井培養這些細胞大約兩週時，他得到了一個驚喜：皮層細胞自發地開始形成分層結構，最終與15天大的小鼠的皮層非常相似。當移植到新生小鼠的大腦中時，該結構存活了下來。“我們就是這樣做的，”笹井說。“我們設定允許的條件，選擇合適的培養基和細胞數量。但之後我們就什麼也不做了。讓它們繼續生長，讓它們做自己的工作。”
然而，實驗室培養的皮層並不完美：例如，它只具有大腦皮層的六個細胞層中的四個。笹井認為視網膜——一種從胚胎大腦中長出的分層組織，其中包含感光光感受器——可能更容易培養。視網膜比皮層薄，在胚胎髮育的早期形成，並且不需要複雜的血管系統。
為了使他的系統適應不同型別的組織，笹井對培養條件進行了微小的改變，這些改變將細胞推向發育的道路。他將熒光“報告基因”透過基因工程改造到幹細胞中，以便當細胞分化成所需的型別（在本例中為視網膜前體細胞）時表達，並揭示系統是否正常工作。“我們的成功取決於瞭解細微的修改如何導致巨大的變化，”他說。
事實證明，培養視網膜只需要做一些調整，例如降低生長因子的濃度，並新增一種稱為Matrigel的標準細胞培養成分。其結果與胚胎中的眼睛發育非常相似（見“如何培養眼睛”）。在培養的第六天，腦球開始長出氣球狀的視網膜細胞生長物，然後這些生長物自身塌陷，形成雙層視杯。笹井的團隊將它們剪下來——“就像從樹上摘蘋果一樣，”笹井說——將它們轉移到不同的培養環境中，讓它們自由生長。兩週後，這些視杯形成了視網膜的所有六層，這種結構與8天大的小鼠的眼睛相似（在這個年齡，小鼠仍然是盲的）。這些細胞能夠在沒有周圍組織支援的情況下自行完成這一戲劇性的生物力學過程1讓笹井和任何其他人一樣感到震驚。“當我看到它時，我想，'我的天啊'。形狀、拓撲結構和大小都被重現了，”他說。他小心翼翼地解釋了接下來要說的雙關語，他補充說：“在英語中，當你感到驚訝時，你會說 'eye-popping' ——所以我們真的認為這太令人震驚了。”
用人類細胞重現結果是顯而易見的，但並非簡單的下一步。倫敦大學學院的眼科醫生和神經科學家彼得·科菲嘗試按照笹井的配方用人類細胞培養視杯，正如科菲所說，“徹底失敗了”。笹井今年報告10說他已經完成了這項壯舉，他說這需要仔細調整，以適應人類胚胎幹細胞的敏感性。例如，因為這些細胞的生長速度比小鼠的細胞慢三倍，所以笹井必須從9,000個細胞開始，而不是3,000個。科菲說他的經驗讓他意識到笹井的實驗室積累了多少專業知識。“他們已經做了很長時間了。真棒，”他帶著善意的嫉妒說。
萬眾矚目
所有這些都不會創造出可以像燈泡插在燈座上一樣插入眼眶的眼睛。即使笹井能夠讓他的視杯發育成成熟的視網膜，研究人員也幾乎不知道如何將移植的視網膜連線到大腦上。
這項工作提供的潛在優勢是能夠獲得大量純淨、高密度、組織良好的感光細胞，並且可以精確選擇其發育階段——這在標準的二維培養中難以實現。佐佐井最終希望，他的視杯能夠提供感光細胞薄片，這些薄片可以被植入到因視網膜色素變性或黃斑變性等疾病而受損的視網膜中。佐佐井透過拿起一疊紙來代表視網膜層，然後將一張紙滑入其他紙張之間來演示該過程。
但是，正如研究眼部幹細胞技術的其他研究人員所發現的那樣，將移植的感光細胞與視網膜的其餘部分以及大腦連線起來並非易事。加利福尼亞州聖莫尼卡的幹細胞治療公司Advanced Cell Technology的首席科學官羅伯特·蘭扎對此持懷疑態度。“我不認為我們已經接近能夠以任何有意義的方式連線這些細胞的時候，”他說。
阿里則更加樂觀。今年四月，他的團隊報告11稱，他們透過移植從幾天大的小鼠身上提取的感光細胞前體細胞，改善了部分失明小鼠的視力。阿里和佐佐井的另一位合作者、理研發育生物學中心的Masayo Takahashi，正在開始提取使用佐佐井的方法培養的感光細胞薄片，並將它們移植到小鼠體內；高橋計劃在年底前將其移植到猴子體內。他們都對早期結果保持謹慎，但高橋表示，在小鼠體內，移植的感光細胞“存活良好”。
激素挑戰
佐佐井將目光投向了更復雜的神經組織。去年11月，他報告3形成了垂體的一部分——他迄今為止“最複雜”的組織。在胚胎中，垂體是在兩個不同的組織整合形成囊狀結構時產生的。佐佐井透過體外再現了這一過程，部分原因是使用了比培養小鼠視網膜多三倍以上的胚胎幹細胞；這種調整似乎增加了細胞交換的訊號水平。當移植到垂體被敲除的小鼠體內時，這些初級器官恢復了內分泌系統並挽救了小鼠的生命。這項工作最終也可能提供純淨的、特化的細胞供應，可用於治療內分泌疾病。
佐佐井希望透過培養更好的垂體（配備血液供應）、包含所有六層組織的腦皮層以及足夠成熟到可以檢測光線的感光細胞來改進他早期的工作。但他接下來的主要任務是培養小腦，這將涉及培養和整合三種不同胚胎來源的組織。這位“媒人”已經在努力營造合適的氣氛。“當一個男孩遇到一個女孩時，他們會開始自己的故事——但不是在擠滿人的大禮堂裡，”他說。“你需要把他們放在海灘上或迪斯科舞廳裡。我們的系統只是要創造這種環境。”
佐佐井計劃在小腦之後研究什麼是一個秘密，但他希望最終能夠涵蓋整個大腦。他的意思不是要建造一個大腦——那將是非常困難且在道德上充滿爭議的。相反，他想弄清楚大腦的各個部分，它們具有驚人的自主生長和組織能力，是如何結合並摺疊成如此複雜結構的。
“我不想成為一個零件製造者，製造越來越多的組織，”佐佐井說。“我總是想要一些概念上不同的東西。”