在子宮中，一個相同的細胞球會產生各種不同的細胞型別，最終形成高度有序的結構，進而形成人體內各種各樣的器官。這個過程按照內在的生物指令碼進行，指導組織的每一次摺疊和皺褶都呈現出完全正確的形狀和尺寸。
熟悉從簡單部分到複雜系統這一發展程序的科學家們，從未停止以一種既帶有一絲驚奇又渴望在實驗臺上複製早期發育過程的心情來思考胚胎髮育——既為了更好地理解生物學，也為了將這些資訊轉化為修復和替換受損組織的方法。他們的時代可能已經來臨。近期在破譯發育複雜性方面取得的成功，提高了在外科手術室中使用體外培育的替代器官的可能性，而這一天可能在短短10年內到來。
我對這一預測的樂觀態度來自於我實驗室近期關於幹細胞的研究，幹細胞會進一步分化成其他細胞型別。我們證明，即使在培養條件下生長，幹細胞也能產生視網膜，這是眼睛內的關鍵結構，它將來自外部世界的光線轉化為電訊號和化學訊號，然後傳遞到大腦的其他部分。在其他工作中，我的同事和我還培育出了皮質組織和垂體的一部分。在進行這些實驗時，我們利用了我們對人體自身內在訊號系統的不斷深入的理解，誘導培養皿中扁平的分散細胞層形成輪廓分明的三維結構。利用我們提供的化學訊號，幹細胞本質上是自主地構建了自己的視網膜。這一成功激發了人們的希望，即透過這種方法產生的視網膜組織可以幫助治療多種眼部疾病，包括黃斑變性。
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漂浮物
當我的實驗室開始嘗試培育視網膜時，我們試圖回答關於視網膜如何形成的基本問題。我們知道視網膜是從胚胎大腦的一部分——間腦中產生的。在早期胚胎髮育過程中，間腦的一個部分擴張形成視泡，一個氣球狀結構。然後，視泡向內摺疊，呈現出視杯的形狀，這種組織最終會進一步變形成為視網膜。
一個多世紀以來，生物學家們一直在爭論視杯形成的確切機制，這種爭論在研究發育中大腦的科學家中仍然存在。一個懸而未決的問題涉及鄰近結構的作用，例如晶狀體和角膜。一些觀察者聲稱，晶狀體物理性地推動視網膜向內彎曲，而另一些人則認為，視杯可以在沒有附近晶狀體組織的幫助下形成。
觀察活體發育中的動物正在發生的事情非常困難，因此大約在10年前，我的團隊決定看看我們是否可以透過分離眼睛的發育來了解更多資訊——本質上是將胚胎幹細胞放入培養皿中，將它們暴露於已知參與眼睛形成的化學物質中，並觀察會發生什麼。胚胎幹細胞是最不成熟的幹細胞型別，最終會分化成身體各種不同的組織型別，從神經元到肌肉細胞。
當時還沒有從培養物中的幹細胞生成器官的技術。嘗試使用這些細胞構建新器官的方法是在人工支架上播種單個細胞，支架的形狀像膀胱或食道。組織工程師在使用這種技術培育實際器官方面取得了一些成功。出於這個原因，我們嘗試了一種不同的方法。作為這個過程的序曲，我們在2000年設計了一種細胞培養方法，將小鼠胚胎幹細胞轉化為各種型別的神經元。然後，我們將單層胚胎小鼠幹細胞放在培養皿中，以及“飼養”細胞，這些細胞傳遞化學訊號，促使幹細胞成熟，超越其胚胎狀態。我們理解，這種扁平的細胞片並沒有複製實際人體器官的三維輪廓，但我們想看看細胞自身的化學訊號是否足以促使它們產生眼睛早期發育過程特有的特殊型別神經元。
起初我們沒有取得太大成功，但在2005年，我們透過發明一種方法取得了技術突破，超越了我們實驗室早期幹細胞技術的二維限制，並允許幹細胞漂浮在培養液中。我們開始將這種三維培養，稱為懸浮培養，用於多種目的。首先，細胞的三維聚集體比在扁平細胞片中形成的結構更能生成複雜的組織拓撲結構。其次，一個細胞需要與另一個細胞交流才能發育成複雜的結構，而三維培養更適合促進這種交流，因為細胞可以更靈活地相互作用。
應用這種新方法，我們將分離的細胞懸浮在實驗室培養皿的孔中少量液體培養基中，發現它們開始與孔中的其他細胞結合在一起。這些小的細胞聚集體，通常每個孔3000個細胞，可以被誘導分化成與大腦前部相同的神經祖細胞（未成熟的神經細胞）。然後，細胞開始相互發出訊號，並在三到四天後，自發地組織成由單層細胞片形成的空心球體，即神經上皮。我們將這種製造細胞片的方法稱為SFEBq（serum-free floating culture of embryoid body–like aggregate with quick reaggregation）培養。
在胚胎中，神經上皮細胞在接收到來自細胞外部的外部化學訊號後，最終形成特定的腦結構。其中一個訊號觸發了間腦的發育，間腦隨後產生視網膜和下丘腦（控制食慾和許多其他基本身體功能的大腦區域）。一旦我們在實驗室中獲得了形成球體的細胞，我們就嘗試透過在SFEBq培養物中新增蛋白質混合物（包含在胚胎中執行相同任務的化學物質），誘導組成細胞分化成視網膜祖細胞——成熟視網膜細胞的前體。
在這些球體在懸浮培養中保持數天後，視網膜上皮組織自發地向外突出，或稱外翻，並形成類似視泡的結構。此外，視泡自發地改變形狀：球體主體外部的上皮部分向內摺疊。這種運動產生了類似於胚胎眼睛視杯的白蘭地酒杯狀。
換句話說，僅在培養皿中聚集分離的幹細胞就產生了一個有序的結構——一個真正令人瞠目結舌的結果。與胚胎中不同，視杯旁邊沒有形成晶狀體或角膜。這一發現為長期存在的問題提供了一個明確的答案，即這種原始視網膜是否需要來自鄰近組織（如晶狀體細胞）的外部力量。視網膜的形成，至少在體外，是一種基於這些細胞內部程式進行的自組織現象。
視網膜分層
在胚胎中看到的正常發育在實驗室培養皿中繼續進行。當我們將視杯在懸浮培養中額外培養兩週時，組織生長到大約兩毫米直徑，單層視網膜上皮變成，就像在胚胎中一樣，一個分層結構，包含在出生後視網膜中發現的所有六類細胞。這種層狀材料包含一個外部光感受器層和一個最內層的神經節細胞層，在體內，神經節細胞層將視網膜連線到大腦。在它們之間，正如在真正的視網膜中所預期的那樣，是幾個連線層，稱為中間神經元。與之前一樣，多層結構的形成是透過一個內部程式實現的，該程式指導製造哪種型別的細胞以及如何在三維空間中排列它們。
我們的工作尚未結束。關於視杯如何形成以及細胞球如何產生圖案結構的問題仍然存在。從均勻的物質團塊中自發地出現複雜的形狀被稱為對稱性破缺，並且在整個胚胎髮育過程中都會發生。如果不是對稱性破缺，受精卵的重複細胞分裂將不會超越未分化的細胞團塊。我們的自組織胚胎幹細胞培養似乎是理解哺乳動物胚胎發生過程中這種難以捉摸的機制的理想實驗平臺。
另一個懸而未決的問題與視網膜上皮（最初只是一層細胞）如何規劃視杯的形狀有關。一般來說，機械力和硬度控制著上皮組織的變化。透過測量體外視杯形成過程中上皮組織不同部位的力和組織硬度的方向，我們發現了導致組織結構形成的三個步驟。隨著視杯的形成，視網膜的硬度降低，柔韌性增加。同時，視網膜和上皮組織交界處的細胞呈現楔形，最後，視網膜由於其快速擴張而開始向內摺疊。這三個步驟對於視杯的形成至關重要。事實上，當計算機模擬中引入與組織力學相關的這些條件時，熟悉的白蘭地酒杯形狀就出現了。
為了看得更清楚
當然，聽到我們研究的人們想知道，對小鼠胚胎幹細胞的研究最終是否會幫助患有眼疾的人。我們在這方面取得了一些進展。值得注意的是，我的實驗室最近報告了成功地從人類胚胎幹細胞中形成了視杯和多層神經組織。預計相同的培養方法也應適用於人類誘導多能幹細胞——成熟細胞，這些細胞被誘導經歷逆向發育過程，使其表現得像胚胎幹細胞。我們還發明瞭一種改進的冷凍儲存方法，可以可靠地將人類胚胎細胞衍生的視網膜組織儲存在液氮中。
所有這些工作都將推動我們走向視網膜組織的醫療應用。例如，我們或許能夠創造出人工視網膜，幫助研究人員探索常見眼病的病理學，或許可以導致開發出藥物和基因療法來逆轉視網膜變性。
視網膜變性分為三類，可能會從我們的研究中受益——黃斑變性、視網膜色素變性和青光眼——影響著全球數百萬人。每種疾病都會導致視網膜不同層面的問題。在黃斑變性中，上皮組織的完整性因支援組織的破壞而受損，這種破壞導致光感受器的退化，尤其是在視網膜的中心區域。在視網膜色素變性中，稱為視杆細胞的光感受器的數量在多年內逐漸減少。“夜盲症”是最初的常見症狀。之後，患者會失去大部分視野，只剩下一箇中心小區域。最後，青光眼會損害神經節細胞，神經節細胞透過投射視神經將視網膜連線到大腦後部皮層的視覺處理中心。
在三種疾病中，黃斑變性似乎最容易透過細胞替代療法得到緩解。當在傳統培養物中以及透過我們的方法生長時，人類胚胎幹細胞和誘導多能幹細胞可以相對容易地產生支援組織，稱為視網膜色素上皮，並且可以直接從這些培養物中回收細胞。在美國，早期小規模的這些細胞臨床試驗已經開始，其他國家也計劃進行類似的試驗。在這些研究中，幹細胞衍生的色素上皮細胞透過細針注射到色素上皮和光感受器層之間的空間，以替換至少部分受損組織。
視網膜色素變性的細胞療法需要更多的技術進步才能提供給人類。與傳統培養物不同，我們的技術可以在適合移植的細胞密集片層中生成視杆光感受器，但我們需要另一個關鍵工具，才能使這種片層的移植能夠改善視力。與上皮組織的簡單支援組織不同，光感受器需要整合到眼睛的神經迴路中；具體來說，它們需要重新連線到另一種感覺細胞，即雙極細胞，而我們尚不知道如何有效地實現這種連線。如果光感受器的移植成功，預計將使即使是晚期視網膜色素變性的患者也能恢復至少部分視力。
青光眼可能是這三種疾病中最難透過細胞療法治療的。胚胎幹細胞培養能夠產生這項工作所需的神經節細胞。然而，在出生後的眼睛中，視神經再生受到抑制，沒有人知道如何誘導它們的軸突（將訊號傳送到大腦並形成視神經的分支）與其他細胞重新連線。
我們已經瞭解到，胚胎幹細胞衍生的組織可以做的事情遠比我們目前透過人工組織工程（將細胞放置在形狀像皮膚層或膀胱的支架上）所能實現的要多得多。作為研究人員，我們必須謙虛而耐心地揭示發育中的細胞可以教會我們什麼，關於從單個細胞到一個像眼睛一樣複雜的器官的複雜過程。