尋找血友病的基因療法被證明是困難的

 馬丁從未學會騎腳踏車，不能和他的朋友們踢足球，並且在花園裡玩耍時戴著頭盔，以防萬一碰傷頭部。他的父母有充分的理由保護他：他患有嚴重的B型血友病，意味著最輕微的觸碰都可能導致嚴重的、使人衰弱的出血。“患有血友病長大是非常令人沮喪的，”馬丁說。“你想和其他孩子一樣，但你不能。”

由於遺傳基因突變，B型血友病患者缺乏一種名為凝血因子IX的蛋白質，這種蛋白質對於形成血凝塊至關重要。目前，患者每週需要多次接受濃縮蛋白質的輸注治療。這可以止血，但不能解決疾病的根本原因，也不能完全消除其使人衰弱的症狀。

幾年前，馬丁不得不停止他作為卡車司機的工作。“我讓公司失望了，因為我無法去上班，”他說。“關節出血使我移動非常痛苦。” 2011年，在經歷了37年的疼痛和內部出血引起的關節退化後，馬丁在倫敦皇家自由醫院報名參加了一項基因治療臨床試驗，希望它能提供一些緩解。

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該療法旨在讓身體自行產生功能性凝血因子，而不是輸注功能性凝血因子。含有功能性凝血因子IX基因的DNA被捆綁到病毒（稱為AAV8）的分子外殼中，然後被輸送到肝細胞中，凝血因子IX通常在那裡產生。

在入組的六名患者中，有四名在治療後能夠停止輸注治療。馬丁是其中之一：他的凝血因子IX水平顯著增加，使他脫離了重度血友病患者的範圍，進入了中度組。此後，他的凝血因子水平一直保持穩定。

對於愛德華·塔登漢姆（Edward Tuddenham）來說，這次成功是至關重要的一步，他是倫敦大學學院的血友病榮譽退休教授，也是該臨床試驗的負責人。他希望找到一種不僅針對B型血友病的療法，而且也針對更常見的A型血友病的療法——但這被證明是一個挑戰。

言論自由
病毒載體AAV8是治療B型血友病的理想選擇，但對於A型血友病效果較差。這是因為編碼A型血友病中缺失的凝血因子（凝血因子VIII）的DNA大約是凝血因子IX的六倍大，因此它不適合AAV8。為了使其適合，研究人員經常從凝血因子VIII基因序列中切除4500個鹼基對。他們刪除的部分編碼了蛋白質的一個特定區域——稱為B結構域——它確保凝血因子VIII的有效分泌。塔登漢姆和他的同事們嘗試用一個大小為五十分之一的DNA序列代替它，但具有相同的功能。但在2010年對血友病小鼠的研究中，這些B結構域修飾的治療方法並沒有提高血液中凝血因子VIII的表達水平。從那時起，塔登漢姆不僅一直在嘗試修復基因，還在努力提高其表達。

凝血因子VIII基因產生蛋白質的速率部分受到DNA鹼基三聯體（密碼子）位置的影響，這些密碼子決定了遺傳物質翻譯成蛋白質的起始和終止位置。正常小鼠或人凝血因子VIII基因的DNA序列中的起始和終止密碼子並不能促進旺盛的蛋白質生產。“因此，我們用更好的密碼子替換了它們，”塔登漢姆說。完成這項工作後，血友病小鼠模型中的表達水平從健康小鼠的約2%提高到約2000%。密碼子最佳化產生的增加是“巨大的，真正令人震驚的”，他說。

2015年，塔登漢姆和他的團隊希望領導試驗，以測試他們最佳化的凝血因子VIII基因療法對A型血友病患者的安全性和有效性。試驗人數可能在10到20人之間，但即使凝血因子在人體內有效表達，仍然有障礙需要克服。

在血小板上遞送
一個障礙是AAV8只能給藥一次，因為該病毒會引發強烈的免疫反應。“用AAV8治療一次後，你永遠不能重複給藥。你會對其產生免疫，”塔登漢姆說。因此，雖然基因療法可能是一次性治癒，但如果在療法到達目標之前免疫反應被觸發，它就毫無用處。

威斯康星州密爾沃基市兒童醫院研究所的大衛·威爾科克斯（David Wilcox）希望透過使用人體自身的細胞來遞送凝血因子VIII來解決這個問題。他正在開發一種將功能性凝血因子VIII插入稱為α-顆粒的結構中的方法，α-顆粒存在於稱為血小板的血細胞內（見右圖）。血小板是第一個到達傷口部位的細胞，它們透過釋放化學信使迅速開始幫助形成血凝塊。威爾科克斯正在努力改造血小板，使其也釋放功能性凝血因子VIII。“這消除了AAV和凝血因子VIII蛋白質在身體其他部位漂浮的問題，”威爾科克斯說，“從而避免任何免疫反應。”

然而，首先，威爾科克斯必須從患者身上採集血幹細胞。他使用生長因子誘導骨髓中的幹細胞進入外周血管，在那裡它們可以很容易地被收集。幹細胞佔外周血樣本的2-5%，然後在稱為外周血幹細胞分離術的過程中分離出來，並進行基因治療，使其包含功能性凝血因子VIII。然後，患者接受化療以部分抑制其現有的骨髓幹細胞，然後接受工程改造的幹細胞輸注到血液中。這些細胞會自行回到骨髓，在那裡它們最終會產生含有功能性凝血因子VIII的血小板。

2013年，威爾科克斯使用人凝血因子VIII基因在三隻患有嚴重A型血友病的狗身上測試了該程式——其中兩隻狗不再需要通常的輸注凝血因子VIII治療。正如預測的那樣，沒有一隻狗顯示出對人凝血因子VIII蛋白產生抗體的跡象——當狗被割傷時，血凝塊的形成速度比沒有基因治療時更快。“我們認為凝血因子VIII在創傷部位從血小板中分泌得如此之快，以至於在凝血因子VIII開始修復血管損傷之前，免疫系統沒有時間做出反應，”威爾科克斯說。與塔登漢姆一樣，威爾科克斯的團隊也希望明年開始臨床試驗。

但是，即使血小板可以提供另一種遞送載體，對於患者來說，這可能也是一種令人不快的選擇。“我認為他們為患有AAV抗體或受HIV和肝炎影響的患者提供了一種可行的方法，”塔登漢姆說，“但在幹細胞移植前進行化療的劑量並不輕鬆。”

就地糾正
到目前為止，基因治療試驗主要集中在患有該疾病的成年人身上，但血友病是一種遺傳性疾病，從出生時就開始影響一個人。不幸的是，該技術對於兒童來說不是一個可行的選擇。賓夕法尼亞州費城兒童醫院的血液學家凱瑟琳·海（Katherine High）說，如果將含有透過AAV引入的凝血因子VIII基因輸注到兒童的肝臟中，血液中凝血因子水平最初會增加，就像塔登漢姆2011年試驗中的成年人一樣。但是，隨著兒童的成長，當產生不含功能性凝血因子VIII基因的新肝細胞時，表達水平會降低。

理論上，威爾科克斯的方法可能對兒童有效，因為功能性凝血因子基因已整合到幹細胞的基因組中，並將傳遞給子細胞。然而，在實踐中，沒有負責任的醫生會將患有非致命性疾病（如血友病）的嬰兒或兒童暴露於化療。

避免這些問題的一種有希望的方法是體內基因組編輯，其中突變基因在原位被糾正，而不是被替換。這可能在任何年齡段都有效——但這種治療越早開始越好，因為益處將是終生的。

澳大利亞悉尼新南威爾士大學的梅林·克羅斯利（Merlin Crossley）說，從概念上講，這種方法就像設定一個生物工具來切除基因組的突變區域，然後再設定另一個工具來插入校正後的模板一樣簡單。克羅斯利認為基因編輯療法是治癒血友病的最佳潛在工具。

這可能對兒童尤其有益：隨著肝臟的生長，新的子細胞將包含功能性凝血因子基因。然後，凝血因子將被識別為身體的一部分，並最終消除兒童的血友病。“替換模板是從健康患者克隆的，不會受到免疫系統的攻擊，因為它不被認為是外來的，”克羅斯利說。

海在2011年對小鼠進行的一項研究提供了強有力的證據，證明基因組編輯是一種可行的選擇。在出生後立即，一組小鼠接受了塔登漢姆風格的基因轉移療法；第二組小鼠接受了基因組編輯治療。海發現，即使在手術切除部分肝臟後，接受基因組編輯治療的小鼠體內功能性凝血蛋白的水平仍然很高；相比之下，在接受基因療法的小鼠中，凝血因子水平下降了。“這是這種治療方法的優勢，特別是對於兒童，”海說。

基因組編輯必須精確地靶向要修復的突變，而A型血友病的突變數量之多——超過2000種——使這成為一個挑戰。

海和塔登漢姆都認為，在短期內，基因組編輯不是答案。“從小鼠的概念驗證實驗到人類基因轉移療法的臨床試驗，間隔了14年，”海說。“在我們甚至考慮在成年人（更不用說嬰兒）身上嘗試基因編輯之前，我們還有很多關於大型動物基因編輯的知識要學習。”

將他的血友病程度降低到中度極大地改善了馬丁的生活質量。自從基因治療以來，他接受標準輸注治療的次數不到十次，並說“其中只有一次是嚴重的出血”。他說，報名參加試驗並不是一個容易的決定，因為沒有任何其他類似的試驗可以作為他決策的依據。但他相信，他的成功經驗應該有助於鼓勵人們參與未來的研究。“你從一個知道自己是什麼樣的人，自己怎麼樣以及如何應對它的位置，到一個完全不確定的位置，”他說。“所以我希望，當其他患者聽到我們的經歷時，不確定性會降低。”

本文經許可轉載，並於2014年11月26日首次發表