1876年，塞繆爾·B·帕森斯收到了一批來自日本的栗子種子，並決定種植和向果園出售樹苗。他並不知道，他的貨物可能藏匿著一個偷渡者，這個偷渡者引發了有史以來降臨北美東部最嚴重的生態災難之一。這些樹木可能隱藏著病原真菌Cryphonectria parasitica的孢子，亞洲栗樹對這種真菌進化出了抵抗力，但它們的美國同類卻沒有。C. parasitica透過在其樹皮中形成潰瘍——植物組織壞死的凹陷區域——來有效地扼殺易感樹木，這些潰瘍環繞樹幹，切斷根和葉之間水分和養分的流動。在50年內，這種真菌就殺死了超過30億棵美國栗樹。
在20世紀初期之前，美國栗樹約佔美國東部落葉林及其在加拿大一小部分的範圍內硬木樹的25%。落葉林主要由秋季落葉的樹木組成。如今，只剩下少數完全長成的栗樹，以及數百萬個樹根樁。這些“活樹樁”偶爾會設法長出一些嫩芽，這些嫩芽可能會存活10年或更長時間。但是，這些樹木很少能活到結籽的時候，因為真菌幾乎總是將它們擊退。
在其鼎盛時期，美國栗樹是一種關鍵物種，對其生態系統中眾多生物的健康至關重要。許多不同的鳥類、昆蟲和小型哺乳動物在它的樹枝上築巢，並在它的樹皮中打洞。熊、鹿、火雞、藍松鴉、松鼠和其他動物吃營養豐富的大栗子。在失去了如此多的成熟栗樹後，野生動物種群數量下降，多樣性也降低。自那以後取代栗樹的橡樹無法支援那麼多的動物；它們產生的橡子只有栗子一半的營養。而且，栗子曾經比今天的橡樹產生更多的堅果，部分原因是它們在可能摧毀嬌嫩花蕾的霜凍之後開花。
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美國栗樹也具有巨大的經濟價值。它的堅果可以用於食品或乙醇燃料。由於美國栗樹生長迅速，木材質地堅固、紋理筆直且非常耐腐爛，因此它提供了優質的木材。事實上，如果栗樹仍然豐富，那麼大多數甲板很可能由其木材製成，而不是由經過壓力處理的木材製成，後者通常含有重金屬和其他防腐劑，當它們進入土壤和食物時，會危及環境和人們的健康。最後，美國栗樹一直是一種特別受人喜愛的樹木，在詩歌、歌曲、書籍、街道標誌以及全國許多學校、酒店和公園的名稱中被永垂不朽。
我們不必袖手旁觀，眼睜睜地看著美國栗樹成為大多數人遙遠的記憶。數十年的研究成果表明，科學可以恢復這種樹木及其曾經為人類和野生動物提供的所有資源。在一個世紀對抗栗疫病無效的努力之後，現在有兩種方法正在取得一些成功。一種策略試圖利用一種古老園藝技術：雜交，來創造抗病美國栗樹。透過將美國栗樹與小得多的、抗真菌的中國栗樹雜交，研究人員將由此產生的雜交種與其他的美國栗樹進行“回交”，以儘可能地使樹木美國化，同時，希望保留所有負責抗病性的基因。然而，除了相當不精確之外，回交育種還需要許多代和數千棵樹木才能產生適合恢復的個體。
由於這些原因，我和我的許多合作者正專注於第二種方法，這種方法比傳統的育種方法更精確地改變栗樹的DNA，並且有可能更快地產生更抗真菌的樹木。透過從小麥和中國栗樹等其他植物中借用基因，並將它們插入到美國栗樹的基因組中，我們已經創造了數百棵轉基因樹木，其中一些樹木對C. parasitica的防禦能力與亞洲同類一樣好，甚至更好。如果美國農業部、環境保護署和食品藥品管理局批准我們的樹木——這最早可能在五年後發生——它們將是第一個用於將其原生環境中的關鍵物種恢復的轉基因生物。
與使用基因工程和相關生物技術恢復瀕危或滅絕物種的其他努力——例如擬議的恢復旅鴿、袋狼和猛獁象——相比，恢復美國栗樹的努力面臨的障礙要少得多，並且提供的好處也更明確。與克隆的猛獁象和鴿子不同，樹木不需要代孕母親、育兒或社會化。而且，作為一種容納許多其他生物的大型生物，美國栗樹比任何一種動物都能更好地改善森林的健康。
救贖的種子
像今天美國的許多成年人一樣，我小時候對栗樹的瞭解都來自一首標誌性的聖誕歌曲。然而，1983年，當我成為在猶他州立大學與植物病理學家尼爾·範·阿爾芬一起工作的研究生時，我開始對這種壯麗的栗樹及其在異國病原體的魔爪——或者更確切地說是真菌之指——下的滅亡產生了深刻的欣賞和同情。
1989年，當我搬到紐約州立大學環境科學與林業學院時，美國栗樹基金會的斯坦·維爾西格向我的同事查爾斯·梅納德和我提出了一個建議。他希望用一個專注於基因工程的新恢復專案來補充基金會正在進行的栗樹雜交專案，基因工程在當時是一項尖端技術，有望以更快、更精確的方式創造抗性美國栗樹。我的任務之一是找到一種能夠賦予樹木抵抗C. parasitica的基因，而佐治亞大學的梅納德和斯科特·默克爾則開發了允許我們將該基因引入栗樹胚胎的技術——栗樹胚胎是快速繁殖的細胞的微小束，最終會長成成年的樹木。如果一切按計劃進行，幼樹將長成能夠對抗真菌的健壯成樹。
當時，沒有人嘗試過基因工程改造樹木來對抗毒性真菌，但我們有一些關於如何入門的線索。多年來，研究人員已經瞭解了一些關於C. parasitica如何損害栗樹的重要細節。這種病原體生長出羽毛狀的真菌組織網格，稱為菌絲扇，它產生草酸，草酸會腐蝕樹木的樹皮，為真菌入侵騰出空間。隨著真菌楔入樹木，潰瘍會環繞樹幹。
最初，我們專注於尋找削弱菌絲扇的方法。我們知道，許多植物和動物的免疫系統都含有被稱為抗菌肽（AMPs）的小氨基酸鏈，它們可以破壞真菌細胞。以非洲爪蟾的AMP基因為模型，我們從頭合成了基因，以產生可以對抗C. parasitica的AMP肽。我們希望，如果我們能夠透過基因工程改造栗樹來產生即使是少量的這些AMPs，它們也會使菌絲扇變得鬆弛，從而使其變得良性。然而，這種肽是出了名的不穩定分子，所以我們需要一個備用計劃。
大約在同一時間，當時的研究生金·卡梅倫順道來我的辦公室，放下了一本書，書中總結了最近舉行的美國植物生物學家學會年會上提出的許多研究。當我讀到奧薩馬·扎格穆特和蘭迪·艾倫（當時都在德克薩斯理工大學）進行的一項研究時，我有了頓悟時刻。這項研究描述了一種小麥基因，該基因編碼一種名為草酸氧化酶（OxO）的酶，它可以分解草酸——正是栗疫病真菌產生的腐蝕性物質。更妙的是，研究人員已經找到了一種將這種基因引入其他植物的方法。他們將基因放入農桿菌中，農桿菌是一種可以將DNA注入植物細胞指揮中心的微生物，並將植物暴露於該微生物的克隆中。由此產生的轉基因植物對一種噴酸真菌，即核盤菌產生了抗性。也許我們可以用美國栗樹做類似的事情。
在當時，我們無法在栗樹上測試這兩種方法，因為我們仍在研究如何在實驗室中種植挑剔的栗樹。因此，我們決定在另一種樹木——雜交楊樹中實現原理驗證，雜交楊樹經過了充分的研究，並且經常用於實驗。當時在環境科學與林業學院的研究生海英·梁將交付OXO基因和我們的AMP基因，當樹木足夠大時，我們將用Septoria musiva感染它們，Septoria musiva是一種產生大量草酸的真菌，並且可能導致雜交楊樹的葉斑病和潰瘍病。以這種方式處理的大多數樹木都保持相對健康。我們已經透過基因工程改造出了一種抗真菌的樹木。現在我們需要用正確的樹木和正確的真菌來做到這一點。
在梁進行楊樹實驗時，當時也在學院讀研究生的琳達·麥圭根開始著手研究如何從實驗室的胚胎中培育栗樹。有些植物，如胡蘿蔔和矮牽牛，在實驗室中非常容易生長。只要提供足夠的水、養分和某些激素，它們就可以從一片小小的葉子中長出新的芽和根，例如。美國栗樹不是這些配合的植物之一。麥圭根在前人工作的基礎上，花了兩年半的時間學習如何成功地使用農桿菌將小麥基因引入栗樹胚胎，以及隨後如何在實驗室中將胚胎引導成幼樹。通常，構成栗樹胚胎的快速分裂細胞簇在掉到地上的栗子種子的保護殼內生長，最終將根穿過種子並進入土壤，並將綠芽推向陽光。麥圭根學會了如何控制光照、溼度和溫度，以模擬栗子種子內部通常會發生的情況，並微調在微型樹木早期發育的不同階段各種激素混合物的輸送，以誘導根和芽的生長。
2006年，我們能夠在從森林中劃分出來的實驗田中種植第一批轉基因美國栗樹。樹木至少需要兩到三年才能長到我們可以用栗疫病真菌挑戰它們的大小。我們將OXO基因連線到一個啟動子——一種控制細胞讀取基因指令頻率的基因開關——以限制OxO在某些組織中的產生。我們希望由此產生的低水平酶足以對抗真菌，而不會引起任何不良副作用。不幸的是，我們錯了。第一批樹木無法抵抗真菌；它們死亡的速度比通常情況慢一些，但最終還是屈服於疾病。
到2012年，我們為OXO基因設計了一個新的啟動子，並設計了一個新的樹木品系，該品系產生更多的酸降解酶。成功了！這些樹木躲避疾病的能力幾乎與自行進化出抗性的中國栗樹一樣好。我們現在已經開發出一種透過測試只有幾個月大的栗樹葉片來衡量抗病性的方法，因此我們不再需要等待三年才能看到我們的實驗是否有效。在這個測試中，我們在葉片上切開小口，用真菌感染它們，然後等待壞死組織圈從傷口處擴散。死亡斑點越小，樹木的抗性就越強。我們的一些最新樹木，它們在所有組織中都產生OxO，並在2013年種植在田地裡，似乎甚至比中國栗樹更具抗性。我們需要隨著樹木年齡的增長來確認這一發現，但從小麥中借用的基因似乎已經超出了我們的預期。
人們經常問我們，為什麼我們不簡單地找到使中國栗樹產生抗性的基因，並使用它們來代替小麥基因。當我們剛開始我們的研究時，沒有人徹底研究過中國栗樹的基因組，而且定位負責像抗病性這樣複雜性狀的眾多不同基因將花費太多的時間和資源。這些基因中的每一個都只會貢獻樹木對抗真菌能力的一小部分，而且它們中的任何一個單獨使用可能都無法有效地作為防禦手段。
然而，在這一點上，科學家們已經確定了27個可能與中國栗樹的抗病性有關的基因——這是最近在森林健康倡議下，由環境科學與林業學院、佐治亞大學、克萊姆森大學、賓夕法尼亞州立大學、美國林務局、北卡羅來納州立大學、康涅狄格農業實驗站和美國栗樹基金會的許多研究人員共同努力的成果。到目前為止，其中兩個基因似乎都賦予了樹木中等水平的抗性。針對其他候選基因的測試正在進行中。佐治亞大學的約瑟夫·奈恩也給了我們另外兩個基因的副本進行測試：一個用於葡萄酶，它可以幫助製造白藜蘆醇，白藜蘆醇對真菌有毒；另一個是辣椒基因，編碼一種可以直接抑制真菌細胞生長的AMP。
最終，我們希望用許多不同的基因來強化美國栗樹，這些基因以不同的方式賦予抗性。這樣，即使真菌進化出對抗其中一種工程防禦的新武器，樹木也不會束手無策。
冒險一試
今天，超過1000棵轉基因栗樹在田間地塊中生長，主要位於紐約州。美國栗樹恢復的下一個障礙涉及聯邦監管程式。在我們可以在森林中種植樹木之前，FDA、USDA和EPA將希望確保轉基因栗樹在某些意想不到的方面與典型的樹木沒有顯著差異。與雜交樹木不同，雜交樹木在基因上與美國栗樹非常不同，因為它們具有大塊的中國栗樹DNA，而我們的轉基因樹木只有少數新基因。初步測試表明，典型栗樹和工程樹木的根與有益真菌形成相同型別的共生關係，並且在改良樹木和未改良樹木的樹冠下生長著相似的小型植物群落。同樣，相同的昆蟲物種會訪問轉基因栗樹和典型栗樹，並且兩種型別樹木的堅果具有相同的營養成分。
一旦此類測試完成，我們將向USDA、EPA和FDA請願，要求獲得他們給予轉基因作物的相同不受監管的地位。在這裡，美國栗樹將在通常的監管程式中引入一個新的難題。我們不是在農田上種植轉基因生物以獲取利潤；相反，我們正在生產用於恢復的樹木，而沒有金錢收益。就像研究富含維生素A前體的黃金大米的研究人員一樣，我們的動機是公共利益——以及森林的健康。EPA通常向種子公司頒發銷售轉基因種子的許可證，但在我們的案例中，我們沒有人持有許可證，也沒有任何東西可以出售。目前尚不清楚他們會給我們什麼樣的替代批准，但我們決心開創先例。
最後一個障礙是公眾的接受度。令人鼓舞的是，許多通常反對基因改造的人都為美國栗樹開了個例外。有些人認為，因為人類首先造成了栗樹的滅亡，所以人類應該修復它。另一些人則接受，因為我們不尋求利潤，也不為樹木申請專利。
許多人也很高興得知美國栗樹恢復的環境風險微乎其微。轉基因栗樹花粉將引入的基因傳播到其他植物物種的可能性非常小。一種樹木的花粉只能使同一物種或近緣物種受精。美國栗樹在其自然分佈範圍的北部沒有近緣物種。在其分佈範圍的南部，錐栗偶爾會與美國栗樹雜交。但是錐栗也感染了栗疫病，並將受益於一些基因抗性。理想情況下，一些轉基因花粉會將抗性傳播給至少一部分設法開花的剩餘美國栗樹樹樁，從而儘可能地挽救它們的全部遺傳多樣性。如果樹樁確實受益，它們可能會產生一個抗病種群，經過幾個世紀，這個種群可能會使這個曾經高聳的關鍵物種恢復到其在東部森林中的昔日輝煌。
栗疫病不是基因工程可以根除的生物多樣性的唯一敵人。我們正在輸掉與許多其他外來害蟲的戰鬥，例如鐵杉絨球蚜蟲——一種吸食鐵杉樹汁液的蟲子——和翡翠灰螟——一種金屬綠色的甲蟲，其幼蟲在梣樹的樹皮下蛀食——以及導致櫟樹猝死病和核桃千瘡病病原體，僅舉幾例。為了扭轉局面，我們必須迅速行動，而且在大多數情況下，傳統的育種技術太慢而無法發揮作用。現在，我們比以往任何時候都更需要基因工程技術來維護多樣化和健康的森林。
將美國栗樹完全恢復到其以前作為森林之王的地位是一項長達數百年的努力。一旦栗樹透過監管和公眾批准，開始恢復的一個好地方是在復墾土地上。在森林健康倡議和杜克能源的幫助下，試驗地塊現在正在礦山復墾場地種植。其他區域可能包括廢棄的農田和曾經有大量栗樹的歷史遺址。也許有些人會希望在自己的院子裡種植這些標誌性的樹木。一句中國古老的諺語說：“前人栽樹，後人乘涼。” 就美國栗樹而言，我們就是第一代人。