蠑螈的肢體比大多數人的肢體要小一些，也更黏糊糊一些，但在其他方面，它們與人類的肢體並沒有太大的不同。蠑螈的肢體包裹在皮膚中，內部由骨骼、肌肉、韌帶、肌腱、神經和血管組成。一種被稱為成纖維細胞的鬆散排列的細胞將所有這些內部組織結合在一起，並賦予肢體形狀。
然而，蠑螈的肢體在脊椎動物世界中是獨一無二的，因為它可以在截肢後從殘肢上再生。成年蠑螈可以一次又一次地再生失去的手臂或腿，無論該部位被截肢多少次。青蛙在蝌蚪階段，當它們的肢體剛開始長出時，可以重建肢體，但它們在成年後會失去這種能力。甚至哺乳動物的胚胎也具有一定的替代發育肢芽的能力，但這種能力也在出生前很久就消失了。事實上，這種在生物體發育過程中再生能力下降的趨勢反映在更高等動物形式的進化中，使得低等的蠑螈成為唯一一種仍然能夠在整個生命週期中再生複雜身體部位的脊椎動物。
長期以來，人類一直想知道蠑螈是如何完成這一壯舉的。肢體再生部分如何“知道”缺失了多少肢體需要被替換？為什麼殘肢處的皮膚不會像人類那樣形成疤痕來封閉傷口？成年蠑螈的組織如何能夠保留胚胎的潛力，從而多次從零開始構建整個肢體？生物學家們正在逐漸接近這些問題的答案。如果我們能夠理解自然界中的再生過程是如何運作的，我們希望能夠觸發人類的再生過程，例如再生截肢的肢體，並徹底改變其他嚴重傷口的癒合方式。
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人體對如此嚴重損傷的最初反應與蠑螈的反應並沒有太大的不同，但不久之後，人類和兩棲動物的傷口癒合策略就出現了分歧。我們的策略導致疤痕，相當於再生反應的失敗，但一些跡象表明，人類確實具有重建複雜部位的潛力。實現這一目標的關鍵將是挖掘我們潛在的能力，使我們自身的傷口癒合變得更像蠑螈。因此，我們的研究首先側重於向專家學習如何做到這一點。
來自蠑螈的經驗
當微小的蠑螈肢體被截肢時，剩餘殘肢中的血管會迅速收縮，因此出血受到限制，皮膚細胞層迅速覆蓋截肢部位的表面。在受傷後的最初幾天，這種所謂的傷口表皮會轉變為一層稱為頂端上皮帽 (AEC) 的訊號細胞，這對於成功再生至關重要。與此同時，成纖維細胞從結締組織網中脫離出來，並遷移穿過截肢表面，在傷口中心匯合。它們在那裡增殖形成芽基——一種幹細胞聚集體，將作為新肢體的前體。
多年前，我們在加州大學歐文分校的同事 Susan V. Bryant 的實驗室進行的研究表明，芽基中的細胞相當於蠑螈胚胎髮育肢芽中的細胞。這一發現表明，芽基構建肢體本質上是對動物原始發育過程中肢體形成的概括。這一見解的一個重要含義是，相同的遺傳程式參與了這兩種情況，並且由於人類在胚胎時期會製造肢體，原則上我們應該已經擁有在成年後再生肢體的必要程式。因此，科學家們似乎需要做的就是弄清楚如何誘導截肢的肢體形成芽基。
我們中的一位（Gardiner）——幾年前與加州大學歐文分校的 Tetsuya Endo 合作——採取了一種極簡主義的方法來回答如何製造芽基的基本問題。我們沒有研究蠑螈截肢部位（芽基會在那裡自然形成），而是觀察蠑螈肢體側面的簡單傷口，這些傷口通常只會透過再生皮膚來癒合。我們的想法是，這種傷口類似於未能再生新肢體的哺乳動物截肢肢體的部位。如果我們可以讓整個肢體在通常發生簡單傷口癒合反應的地方生長，那麼我們可以進一步剖析再生過程。
在我們對蠑螈腿部做一個小切口後，表皮細胞遷移以覆蓋和封閉傷口，就像在截肢部位一樣，來自皮膚真皮層的成纖維細胞也移動進來以替換缺失的皮膚。但是，如果我們小心地將神經轉移到傷口部位，我們可以誘導這些成纖維細胞形成芽基。凱斯西儲大學的 Marcus Singer 在半個多世紀前就已證明神經支配對於再生反應是必需的，但我們的實驗澄清了神經提供的未知因子透過改變常駐成纖維細胞的行為來影響再生。
然而，這些誘導的芽基從未發展到再生的後期階段以形成新的肢體。還需要一種成分。誘導產生新肢體的芽基的關鍵是將肢體另一側的一塊皮膚移植到傷口部位，這使得來自肢體相反區域的成纖維細胞能夠參與癒合反應。由此產生的附屬肢體當然是在異常位置長出的，但它在解剖學上是正常的。因此，製造芽基的基本配方似乎相對簡單：您需要傷口表皮、神經和來自肢體相反兩側的成纖維細胞。考慮到肢體再生的這種極簡主義觀點，我們開始專注於理解各個成分的作用。
我們知道，表皮來源於早期發育胚胎中三個原始細胞層之一的外胚層，外胚層也因提供控制肢芽上肢體向外生長的訊號而聞名。外胚層細胞聚集在芽中形成頂端外胚層脊 (AER)，它暫時產生化學訊號，引導下方肢芽細胞的遷移和增殖。
雖然來自表皮的一些關鍵訊號尚未被識別，但成纖維細胞生長因子 (FGF) 家族的成員參與其中。AER 產生許多 FGF，刺激肢芽的下方細胞產生其他 FGF，從而推動 AER 和肢芽細胞之間訊號反饋迴路，這對於肢體的向外生長至關重要。人們認為，AEC 激發的類似反饋迴路在肢體再生過程中以相同方式發揮作用，日本東北大學的井出博之 (Hiroyuki Ide) 發現，青蛙蝌蚪再生能力逐漸喪失與 FGF 迴路啟用失敗有關。透過用 FGF10 處理較老的非再生蝌蚪肢體，他能夠啟動該訊號迴路並刺激截肢肢體的部分再生。
然而，這一結果激發的興奮感被以下事實所緩和：誘導的再生體是不正常的，由不規則放置的肢體部分組成，這提出了一個重要問題，即如何控制再生，以便準確地替換截肢時丟失的所有適當的解剖結構。事實證明，另一個主要的細胞參與者，成纖維細胞，執行此功能。
位置，位置，位置
回想一下極簡主義附屬肢體實驗，成纖維細胞本身的存在不足以進行再生，因為在不產生新肢體的簡單傷口部位存在成纖維細胞。事實證明，來自肢體另一側的成纖維細胞至關重要。這一發現說明了細胞位置在觸發再生反應中的重要性。在胚胎中，肢體發育中的事件順序總是從肢體基部（肩部或髖部）的形成開始，然後逐步構建更遠端的結構，直到該過程以手指或腳趾的形成為止。另一方面，在蠑螈再生中（或腳），截肢部位可能位於肢體長度的任何位置，並且無論傷口位於何處，都只會再生截肢的肢體部分。
這種可變反應表明，截肢傷口邊緣的細胞必須“知道”它們相對於整個肢體的位置。這種位置資訊控制著導致完美替換缺失肢體部分的細胞和分子過程，並且它被編碼在各種基因的活動中。檢查在這些過程中哪些基因在起作用有助於揭示控制再生這一階段的機制。
雖然在胚胎髮育過程中有大量基因參與指導細胞瞭解它們在肢體中的位置，但稱為 Hox 的基因家族的活動至關重要。在大多數動物中，發育中的肢芽中的細胞使用 Hox 基因提供的位置程式碼來形成肢體，但隨後當它們分化成更專業的組織後，它們會“忘記”它們來自哪裡。相比之下，成年蠑螈肢體中的成纖維細胞保留了此資訊系統的記憶，並且可以在肢體再生過程中重新訪問位置 Hox 程式碼。
在再生過程中，成纖維細胞在遷移穿過傷口以啟動芽基形成時，會將此資訊隨身攜帶，一旦進入芽基，細胞就能夠“相互交談”以評估損傷程度。這種串擾的內容在很大程度上仍然是一個謎，但我們確實知道，對話的一個結果是，再生的肢體首先建立其邊界，包括手或腳的輪廓，以便細胞可以使用其位置資訊來填充截肢平面和手指或腳趾之間的缺失部分。
由於肌肉和骨骼構成了肢體的大部分，我們也對這些組織的原始材料來自何處以及控制其形成的機制感興趣。當再生反應啟動時，關鍵的早期事件之一涉及一個知之甚少的稱為去分化的過程。該術語通常用於描述細胞從成熟的專門狀態逆轉為更原始的胚胎狀態，這使其能夠繁殖並充當一種或多種組織型別的前體。
在再生領域，早期科學家首次使用該詞，他們在顯微鏡下觀察到蠑螈殘肢組織，特別是肌肉，似乎分解併產生增殖細胞，形成芽基。我們現在知道，這些與肌肉相關的細胞來源於通常存在於肌肉組織中的幹細胞，而不是來自肌肉的去分化。在再生肢體中的每種組織型別的情況下，去分化是否真的發生還有待證明，儘管很明顯，這種主題的變體確實在再生過程中發生。進入芽基並變成原始芽基細胞的成纖維細胞具有分化成骨骼組織（骨骼和軟骨）的能力，以及例如再分化成將形成新肢體間質網的成纖維細胞。
回到芽基形成中另一個核心細胞參與者，表皮細胞，我們還可以精確定位再生過程中似乎這些細胞正在向更胚胎狀態轉變的時刻。許多在胚胎外胚層中活躍的基因對於肢體發育至關重要，包括 Fgf8 和 Wnt7a，但隨著胚胎外胚層分化形成成人的多層表皮，這些基因被關閉。在成人的再生過程中，遷移穿過截肢傷口並建立傷口表皮的表皮細胞最初開始顯示基因活性，例如產生與再生沒有特定關係的傷口癒合角蛋白。稍後，傷口表皮細胞會啟用 Fgf8 和 Wnt7a 這兩個重要的發育基因。因此，出於實際目的，去分化的基本定義——因為它與表皮和其他細胞型別有關——是基本發育基因的特定重新啟用。
因此，我們對蠑螈的研究表明，再生過程可以分為關鍵階段，從傷口癒合反應開始，然後是由在某種程度上恢復到胚胎狀態的細胞形成芽基，最後，啟動發育程式以構建新的肢體。當我們朝著誘導人類肢體再生的挑戰邁進時，我們依靠這些見解來指導我們的努力。事實上，科學中最難發現的事情是那些尚未發生的事情，而人類的肢體再生恰好屬於這一類，儘管這並不意味著人類沒有自然的再生能力。
指尖的潛力
人類肢體再生是一個可行的目標，最令人鼓舞的跡象之一是我們的指尖已經具有內在的再生能力。這一觀察結果首先在 30 多年前的幼兒中被發現，但此後在青少年甚至成人中也報告了類似的發現。促進指尖截肢損傷的再生顯然就像清潔傷口並用簡單的敷料覆蓋傷口一樣簡單。如果允許自然癒合，指尖會恢復其輪廓、指紋和感覺，並經歷不同程度的延長。醫學期刊已數千次記錄了這種指尖截肢損傷保守治療的成功案例。有趣的是，此類損傷的替代方案通常包括手術縫合皮膚瓣覆蓋截肢傷口，這種“治療”我們現在知道即使在蠑螈中也會抑制再生，因為它會干擾傷口表皮的形成。這些報告中蘊含的深刻資訊是，人類具有固有的再生能力，可悲的是，這種能力已被我們自己的一些傳統醫療實踐所抑制。
研究自然的人類指尖再生是如何運作的並不容易，因為我們不能隨意截肢手指來進行實驗，但幾位研究人員已在幼鼠和成年小鼠中證明了相同的反應。近年來，我們中的兩人（Muneoka 和 Han）一直在更詳細地研究小鼠指尖再生反應。我們已經確定，指尖截肢後確實會形成傷口表皮，但它覆蓋再生傷口的速度比蠑螈慢得多。我們還表明，在指尖再生過程中，重要的胚胎基因在傷口部位未分化、增殖的細胞群中活躍，表明它們是芽基細胞。間接證據表明，它們來源於存在於間質結締組織和骨髓中的成纖維細胞。
為了探索特定基因和生長因子在小鼠指尖再生反應中的作用，我們開發了一種組織培養，作為胎兒小鼠指尖再生的模型。透過它，我們發現，如果我們實驗性地從胎兒截肢傷口中去除一種稱為骨形態發生蛋白 4 (BMP4) 的生長因子，我們會抑制再生。此外，我們已經證明，缺乏一種名為 Msx1 基因的突變小鼠無法再生其指尖。在胎兒指尖中，Msx1 對於 BMP4 的產生至關重要，我們能夠透過在 Msx1 缺陷小鼠的傷口中新增 BMP4 來恢復再生反應，從而證實了 BMP4 對於再生的必要性。
Cory Abate-Shen 及其在羅伯特·伍德·約翰遜醫學院的同事的研究也表明，Msx1 編碼的蛋白質在胚胎髮育過程中抑制多種細胞型別的分化。這種與分化控制的聯絡表明，該蛋白質透過引起細胞去分化在再生反應中發揮作用。雖然 Msx1 在蠑螈肢體再生的早期去分化階段不活躍，但它的姊妹基因 Msx2 是再生過程中最早重新啟用的基因之一，並且很可能具有相似的功能。
人類挑戰 讓人類肢體再生的想法可能仍然更像是幻想而不是一種可行的可能性，但憑藉我們一直在描述的這些見解，我們可以以邏輯的逐步方式評估它可能如何發生。截肢的人類肢體會導致一個大而複雜的傷口表面，該表面橫切許多不同的組織，包括表皮、真皮和間質結締組織、脂肪組織、肌肉、骨骼、神經和血管系統。單獨觀察這些不同的組織型別，我們發現其中大多數實際上都非常能夠再生小規模損傷。
事實上，肢體中唯一缺乏再生能力的組織型別是真皮，真皮由異質細胞群組成，其中許多是成纖維細胞——與蠑螈再生反應中起著如此關鍵作用的細胞相同。在人類和其他哺乳動物受傷後，這些細胞會經歷一個稱為纖維化的過程，該過程透過沉積無組織的細胞外基質材料網路來“癒合”傷口，最終形成疤痕組織。蠑螈再生和哺乳動物再生失敗之間最顯著的區別在於，哺乳動物成纖維細胞形成疤痕，而蠑螈成纖維細胞不形成疤痕。哺乳動物的這種纖維化反應不僅會阻礙再生，而且本身可能是一個非常嚴重的醫療問題，它會永久性和漸進性地損害許多器官（如肝臟和心臟）在損傷或疾病後的功能。
對深層傷口的研究表明，至少有兩類成纖維細胞在癒合過程中侵入傷口。其中一些細胞是存在於真皮中的成纖維細胞，另一些細胞來源於迴圈的成纖維細胞樣幹細胞。這兩種型別都被也湧向現場的免疫細胞的訊號所吸引。一旦進入傷口，成纖維細胞就會遷移和增殖，最終產生和修飾該區域的細胞外基質。這個早期過程與蠑螈傷口中的再生反應並沒有太大的不同，但哺乳動物成纖維細胞會產生過量的基質，這些基質在疤痕組織成熟時會異常交聯。相比之下，蠑螈成纖維細胞一旦正常結構恢復，就會停止產生基質。
然而，哺乳動物中確實存在這種模式的例外。胎兒皮膚中的傷口癒合時不會形成疤痕——產生完美的皮膚再生，表明向纖維化反應的轉變隨著皮膚的發育成熟而出現。雖然這種差異可能反映了成纖維細胞生物學的變化，但更有可能是細胞外傷口環境改變的訊號調節成纖維細胞行為的結果，這反過來表明，治療性地修飾這些訊號可能會改變癒合反應。與此同時，肢體在胎兒發育階段截肢不會導致肢體再生的事實提醒我們，無疤痕傷口癒合可能是再生的必要條件，但並非充分條件。
為了增進我們對誘導人類肢體再生所需的條件的理解，我們正在繼續我們的小鼠研究工作。我們的研究小組已經描述了小鼠截肢損傷中的自然芽基，我們未來一年的目標是在通常不會發生芽基的地方誘導芽基。就像蠑螈的附屬肢體實驗一樣，這一成就將確立芽基形成的最基本要求。我們希望這一研究方向也能揭示，正如我們所懷疑的那樣，芽基本身是否提供防止傷口部位纖維化的關鍵訊號。
如果我們成功地在哺乳動物中產生芽基，那麼我們面臨的下一個巨大障礙將是誘導指截肢部位再生整個手指。這項任務的複雜性比再生簡單的指尖要高出許多倍，因為整個手指包括關節，關節是胚胎髮育過程中身體中形成的最複雜的骨骼結構之一。發育生物學家仍在努力理解關節是如何自然形成的，因此構建再生的滑鼠手指（包括關節）將是再生領域的一個重要里程碑。我們希望在未來幾年內實現這一目標，在那之後，再生整個滑鼠爪，然後是手臂的前景將不會顯得那麼遙遠。
事實上，當我們考慮到我們從各種動物模型的研究中學到的所有關於傷口癒合和再生的知識時，令人驚訝的結論是，我們可能只需要一二十年就可以迎來我們可以再生人體部位的那一天。蠑螈成纖維細胞在指導再生反應中的行為與哺乳動物中導致疤痕形成的纖維化反應之間的鮮明對比表明，通往成功再生的道路上佈滿了這些細胞。同樣令人鼓舞的是，斯坦福大學的 Howard Y. Chang 和 John L. Rinn 最近發現，成年人類成纖維細胞與蠑螈成纖維細胞一樣，保留了用於在胚胎早期發育身體計劃的空間座標系統的記憶。鑑於這種位置資訊是蠑螈再生所必需的，它在人類成纖維細胞中的存在增強了利用和啟用再生所需的發育程式的可行性。
現在，當我們觀看蠑螈長回手臂時，我們不再像以前那樣對它的發生方式感到困惑。很快，人類也許能夠親自利用這種真正令人敬畏的能力，隨意更換受損和患病的身體部位，也許是無限期地更換。