安妮塔碗裡的食物不是普通的狗糧。雖然這個盤子裡有顆粒和溼糧，但還撒上了一層綠色的粉末——這是一項開創性實驗的產物，旨在解決血友病治療中可能致命的併發症。安妮塔之所以得名，是因為她的紅色皮毛讓飼養員想起了動畫電影《101斑點狗》中的角色，她是一隻患有B型血友病的基格犬（比格犬和凱恩梗犬的雜交品種）。
和患有這種罕見遺傳病的人一樣，安妮塔天生缺乏凝血因子IX，這是一種幫助血液凝結的蛋白質。當用替代凝血蛋白治療時，這隻狗自然會產生針對療法的抗體或抑制劑——這個問題在約5%的B型血友病患者中也可見。在這些人中，免疫系統將治療性蛋白質識別為危險物質，導致身體停止接受這種蛋白質作為血液的正常組成部分，並在其阻止出血之前將其破壞。繼續接受因子替代療法可能導致危及生命的過敏反應，如過敏性休克。
對於A型血友病來說，問題甚至更嚴重，A型血友病比B型血友病常見四倍，並且凝血鏈中缺失的環節是一種叫做凝血因子VIII的蛋白質。約30%的A型血友病患者會對替代凝血因子VIII產生抗體。
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有療法可以消除這些抗體。例如，有些人接受一種名為免疫耐受誘導療法的強化治療，該療法包括定期靜脈注射凝血因子。但這既耗時又昂貴（對於一個五歲的普通患者來說，大約需要100萬美元），而且該療法僅對約四分之三的患者有效。“治療患有抑制劑的血友病的挑戰令人震驚，”北卡羅來納大學教堂山分校弗朗西斯·歐文血液研究實驗室主任蒂莫西·尼科爾斯說，該實驗室維護著安妮塔所屬的血友病犬群。
誘導已產生抑制劑的人的免疫耐受是一種方法。但完全避免這個問題會更好。“如果你能首先預防抗體的形成，透過找到某種產生免疫耐受的方法來繞過這種方案，那將是一個主要的優勢，”安大略省金斯頓市女王大學的臨床醫生和出血性疾病專家大衛·利利克拉普說。
安妮塔盤子裡的綠色粉末可能正是這樣做的。這種口服治療是一種濃縮的冷凍乾燥萵苣葉細胞，每個細胞包含約10,000個葉綠體——負責光合作用的細胞器——這些葉綠體經過基因工程改造，可以產生凝血因子IX。這些蛋白質本身不能用於預防出血事件，因為植物細胞中的細胞機制無法將人類凝血因子包裝成生物活性形式。然而，它們可以做的是防止免疫系統對後續治療發起攻擊。
生物工程萵苣背後的研究人員已經表明，透過給小鼠餵食基於這些植物的產品，可以預防抑制劑的形成和嚴重的過敏反應。如果該策略在安妮塔和她的犬舍夥伴身上——最終在人類身上——也有效，那麼它可能構成首個保護血友病治療相關免疫反應的產品的基礎。
安妮塔是僅有的兩隻接受生物工程萵苣的狗之一。“到目前為止，一切進展順利，”賓夕法尼亞大學牙科醫學院轉化研究主任、首席研究員亨利·丹尼爾說，他來自費城。
耐受行為
2006年，利利克拉普證明，簡單的口服治療可以訓練免疫系統不產生抑制劑。他和他的同事使用A型血友病小鼠模型，透過鼻子或嘴巴給小鼠餵食純化的人凝血因子VIII蛋白片段。研究人員發現，在凝血因子VIII替代療法後，該治療在一定程度上提供了針對抗體產生的保護。但這種方法沒有將足夠量的因子輸送到腸道或鼻腔中的免疫細胞，以完全抑制抑制劑的形成。
丹尼爾提出了一種改進的遞送系統。他首先關注B型血友病。丹尼爾及其團隊採用他之前開發的一種延遲1型糖尿病發作的技術，對菸草植物進行基因改造，使其葉綠體中表達人凝血因子IX。（丹尼爾後來改用萵苣。）
葉綠體DNA與植物細胞核中的基因組DNA分離，細胞中大量的這些微小細胞器使得大量的凝血蛋白在每片菸葉中積累。一旦攝入，植物細胞壁會保護凝血蛋白免受胃酸的破壞。消化道下游的腸道微生物隨後會咀嚼細胞壁，釋放凝血因子蛋白。
為了將蛋白質靶向免疫系統，丹尼爾隨後附著了第二種蛋白質，該蛋白質對人類腸道內側發現的受體具有高結合親和力。透過將這種融合構建體束縛在腸壁上，凝血蛋白可以被吸收到體內，並由免疫系統中誘導耐受性的特殊細胞處理。
丹尼爾隨後與蓋恩斯維爾佛羅里達大學的分子生物學家羅蘭·赫爾佐格合作，在動物模型中測試了這種基於植物的產品。2010年，他們表明，以這種方式口服遞送在葉綠體中表達的凝血因子IX導致小鼠體內幾乎檢測不到抑制劑水平，也沒有過敏性休克的跡象。“這些小鼠是健康的，它們沒有表現出過敏反應，也沒有形成抑制劑，”赫爾佐格說。“這非常令人興奮。”
然後，丹尼爾修改了菸葉，使其表達凝血因子VIII，並將葉子粉末運送給赫爾佐格。今年早些時候，這兩位研究人員及其團隊記錄了在A型血友病小鼠模型中抑制劑形成的抑制，甚至逆轉了預先存在的抑制劑。
抑制劑控制
正在研究的其他預防凝血因子療法抑制劑形成的策略包括免疫抑制劑和消耗特定免疫細胞的藥物。然而，這些療法具有許多副作用，包括增加感染的易感性。
一種可能更安全的選擇來自馬薩諸塞州沃特敦的Selecta Biosciences公司。Selecta開發了一種奈米顆粒遞送系統，其中一種免疫調節化合物包含在直徑僅為150奈米的可生物降解塑膠顆粒中。當與凝血因子VIII一起注射到A型血友病小鼠模型中時，奈米顆粒將其有效載荷遞送到淋巴組織中負責啟動免疫反應的細胞。這些細胞反過來指示凝血因子VIII特異性免疫細胞對凝血蛋白產生耐受性，從而抑制對替代療法的錯誤導向的抗體反應——所有這些都不會影響免疫系統的其餘部分。
圖片來源：Kwang-Chul Kwon、Jin Su和Henry
丹尼爾，賓夕法尼亞大學
馬里蘭州貝塞斯達市美國軍事健康科學大學的大衛·斯科特和他的同事與Selecta合作，證明在用奈米顆粒製劑治療後，抑制劑在至少六個月內保持無法檢測到。“這強調了我們實際上是在教導免疫系統對凝血因子VIII產生耐受性，”Selecta的首席科學官高志敬說。
正在測試用於抑制劑控制的奈米技術方法也可能改進目前處於臨床研究前沿的血友病治療：基因療法。使用標準的基因療法方法，研究人員已經表明，他們可以在B型血友病成人體內實現凝血因子IX的長期表達，且水平足夠高，可以將這種出血性疾病轉化為輕度疾病（參見S6頁）。到目前為止，在針對這種病毒療法的臨床試驗的少數人類參與者中，還沒有報告抑制劑形成的證據。
儘管如此，標準的肝臟靶向基因療法仍然存在一系列潛在的併發症，包括有害突變的風險以及身體對用於攜帶導致血友病的缺陷基因的正確形式的病毒載體產生免疫反應的風險。這就是為什麼幾個研究小組試圖用奈米顆粒代替病毒載體，奈米顆粒可以將基因療法作為“DNA藥丸”遞送。
藥丸保護
DNA藥丸將DNA質粒——含有編碼凝血因子VIII或凝血因子IX的基因的細菌環狀DNA片段——與由殼聚糖製成的奈米顆粒結合起來，殼聚糖是一種堅韌的聚合物碳水化合物，存在於甲殼類動物的外骨骼中。殼聚糖保護治療性基因產物並將其護送到腸道。“口服途徑具有顯著的吸引力，”加拿大漢密爾頓麥克馬斯特大學的基因療法研究員岡薩洛·奧特拉諾說。“關鍵是實現一種持久、有效且完全安全的遞送系統。”
奧特拉諾小組以及德國和美國的其他研究團隊的獨立研究表明，這種口服基因療法不會啟用免疫系統。事實上，基於奈米顆粒的基因療法產生的蛋白質暴露於腸道粘膜可以預防抑制劑的產生，並恢復A型和B型血友病小鼠模型中的凝血因子活性。“這種方法確實可能為患者帶來巨大的益處，”輸血醫學專家約爾格·舒特魯普夫說，他領導了在法蘭克福德國紅十字會獻血服務中心進行的一項研究。
紐約市哥倫比亞大學的生物醫學工程師金·梁，他的團隊是第一個在小鼠身上證明這種方法成功的團隊，甚至嘗試給患有A型血友病的狗餵食殼聚糖-DNA奈米顆粒。梁發現了一些基因轉移的證據，以及動物體內抑制劑的減少。但出血時間沒有縮短，如果產生足夠水平的凝血因子VIII，則應該會縮短。“這仍然是一個非常低效的過程，”梁說，“因此需要持續最佳化。”
雖然理想情況仍然是既能糾正疾病又能提供免疫耐受的基因療法，但一些科學家已將重點放在治療抑制劑形成上，而不必擔心修復疾病。在這種策略下，人們仍然需要接受因子替代療法，但他們可以這樣做，而無需擔心抑制劑的產生。
考慮到這一點，由斯科特和赫爾佐格領導的獨立團隊採用了傳統的病毒載體方法，透過基因療法誘導耐受性。但研究人員沒有像大多數基因療法那樣將凝血因子蛋白的整個基因遞送到細胞，而是使用病毒對免疫調節B細胞進行基因改造，使其表達與稱為免疫球蛋白的免疫分子融合的凝血因子片段。這導致了A型和B型血友病小鼠模型的長期耐受性。
赫爾佐格說，追求這種基因療法方法提供了一定程度的對沖。“每種策略都有潛在的優勢和劣勢，”他指出，“我們還不真正知道哪種策略會有效，或者哪種策略可能在人體中最有效。”由於如此多的治療策略正在透過臨床前管道推進，科學家和臨床醫生仍然希望至少有一種策略最終會成功，從而徹底消除血友病患者抑制劑形成的問題。
本文經許可轉載，最初於2014年11月26日首次發表