自從去年 10 月以來，分子生物學家 Katsuhiko Hayashi 收到了大約十幾封來自夫婦的電子郵件，他們大多是中年人，迫切渴望一件事：一個嬰兒。一位來自英格蘭的更年期婦女提出要到他在日本京都大學的實驗室，希望他能幫助她懷孕。“這是我唯一的願望，”她寫道。
在 Hayashi 發表了一項實驗的結果後，這些請求開始陸續出現，他原本認為這項實驗主要會引起發育生物學家的興趣。他從體外培養的小鼠皮膚細胞開始，建立了原始生殖細胞 (PGC)，這些細胞可以發育成精子和卵子。為了證明這些實驗室培養的版本與自然發生的 PGC 真正相似，他用它們來製造卵子，然後用這些卵子製造了活的小鼠。他稱這些活產只是研究的“副作用”，但這個實驗室實驗變得意義重大，因為它提出了從不孕婦女的皮膚細胞中製造可受精卵的前景。它還表明，男性的皮膚細胞可以用來製造卵子，女性的細胞可以用來產生精子。（事實上，在研究發表後，一家同性戀雜誌的編輯給 Hayashi 發郵件索取更多資訊。）
儘管這項研究具有創新性，但公眾的關注讓 Hayashi 和他的資深教授 Mitinori Saitou 感到驚訝。他們花了十多年的時間拼湊哺乳動物配子產生的微妙細節，然後在體外重新建立這個過程——這一切都是為了科學，而不是醫學。他們的方法現在允許研究人員建立無限量的 PGC，而這些 PGC 以前很難獲得，這種珍貴細胞的定期供應有助於推動哺乳動物繁殖的研究。但是，當他們推動從老鼠到猴子和人類的科學挑戰性轉變時，他們正在為不孕症治療的未來，甚至可能是在生殖方面更大膽的實驗設定方向。科學家和公眾才剛剛開始探討相關的倫理問題。
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加州大學洛杉磯分校的生育專家 Amander Clark 說：“不用說，[他們]確實改變了小鼠領域。現在，為了避免這項技術在有機會展示其用途之前就脫軌，我們必須就以這種方式製造配子的倫理問題進行對話。”
回到起點
在小鼠中，生殖細胞在胚胎髮育的第一週後出現，表現為大約 40 個 PGC 的一組。這個小群體繼續形成雌性小鼠出生時擁有的數萬個卵子，以及雄性每天產生的數百萬個精子細胞，它將傳遞小鼠的整個遺傳遺產。Saitou 想了解哪些訊號指導這些細胞在整個發育過程中的發展。
在過去的十年中，他辛辛苦苦地鑑定了幾個基因，包括Stella、Blimp1 和 Prdm14，當這些基因在特定的組合中和特定的時間表達時，它們在 PGC 發育中起著至關重要的作用。他使用這些基因作為標記，能夠從其他細胞中選擇 PGC，並研究它們會發生什麼。2009 年，在日本神戶的理化學研究所發育生物學中心進行的實驗中，他發現當培養條件合適時，只需在精確的時間新增一種成分——骨形態發生蛋白 4 (Bmp4)——就足以將胚胎細胞轉化為 PGC。為了檢驗這個原理，他向胚胎細胞中添加了高濃度的 Bmp4。幾乎所有這些細胞都變成了 PGC。他和其它科學家都認為這個過程會更復雜。
圖片來源：《自然》雜誌
以色列雷霍沃特魏茨曼科學研究所的幹細胞專家 Jacob Hanna 說，Saitou 的方法——一絲不苟地遵循自然過程——與其他人正在進行的工作形成了鮮明的對比。許多科學家試圖透過用訊號分子轟擊幹細胞，然後從成熟細胞的混合物中挑選出他們想要的細胞，在體外建立特定的細胞型別。但是，這些細胞是如何形成的，或者它們與自然版本有多相似，這一點永遠不清楚。Saitou 努力找出製造生殖細胞需要什麼，消除多餘的訊號，並注意各種分子發揮作用的確切時間，這給他的同事留下了深刻的印象。“這項工作中蘊含著一個非常美麗的隱藏資訊——細胞[在體外]分化真的不容易，”Hanna 說。英國謝菲爾德大學的幹細胞生物學家 Harry Moore 認為，對生殖細胞發育的仔細再現是“一項勝利”。
在 2009 年之前，Saitou 的起點是取自活體小鼠外胚層的細胞——外胚層是一種杯狀的細胞集合，覆蓋在胚胎的一端，在發育的第一週末形成，就在 PGC 出現之前。但是為了真正掌握這個過程，Saitou 希望從容易獲得的培養細胞開始。
那是 Hayashi 的一個專案，他於 2009 年從英國劍橋大學返回日本，像之前的 Saitou 一樣，他在該領域先驅 Azim Surani 的實驗室完成了為期四年的工作。Surani 對這兩位科學家評價很高，他說他們“在性格和解決問題的方式和方法上互補”。Saitou “有條理”，並且“一心一意地設定和完成他的目標”，而 Hayashi “工作更憑直覺，對這個主題有更廣闊的視野，並且表面上採取更放鬆的方法”，他說。“他們共同組成了一支非常強大的團隊。”
Hayashi 加入了京都大學的 Saitou，他很快發現這裡與劍橋大學不同。Hayashi 習慣於花在理論討論上的時間少了很多；相反，人們會直接投入到實驗中。“在日本，我們只是做。有時這可能非常低效，但有時會取得巨大的成功，”他說。
Hayashi 試圖使用外胚層細胞——Saitou 的起點——但是他沒有像 Saitou 那樣使用提取的細胞，而是試圖將它們培養成一個可以產生 PGC 的穩定細胞系。那沒有奏效。Hayashi 隨後借鑑了其他研究，這些研究表明，一種關鍵的調節分子（啟用素 A）和一種生長因子（鹼性成纖維細胞生長因子）可以將培養的早期胚胎幹細胞轉化為類似於外胚層的細胞。這激發了使用這兩個因子誘導胚胎幹細胞分化為外胚層的想法，然後應用 Saitou 先前的公式來推動這些細胞成為 PGC。這種方法是成功的。
然而，為了證明這些人工 PGC 是真實的副本，必須證明它們可以發育成可行的精子和卵子。這個過程很複雜而且人們不太瞭解，因此研究團隊將這項工作交給了自然——Hayashi 將 PGC 插入到無法產生自身精子的小鼠的睪丸中，然後等待觀察這些細胞是否會發育。Saitou 認為這會奏效，但很擔心。“這看起來像是 50/50 的機會，”他說。“我們既興奮又擔心。”但是，在第三或第四隻小鼠身上，他們發現睪丸中有又粗又黑的生精小管，裡面塞滿了精子。“它發生得非常順利。我知道它們會產生幼崽，”Hayashi 說。該團隊將這些精子注入卵子，並將胚胎植入雌性小鼠體內。結果是可生育的雄性和雌性（見“製造嬰兒”）。
他們用誘導多能幹 (iPS) 細胞重複了這個實驗——這些細胞是已經被重程式設計為類胚胎狀態的成熟細胞。同樣，精子被用來產生幼崽，證明它們具有功能——在幹細胞分化領域，這是一種罕見的成就，科學家們經常爭論他們創造的細胞是否真的是它們看起來的樣子。“這是整個多能幹細胞研究領域中為數不多的幾個例子之一，其中從培養皿中的多能幹細胞開始明確地產生了一種完全功能的細胞型別，”Clark 說。
他們預計卵子會更復雜，但去年，Hayashi 用一隻具有正常顏色的老鼠的細胞在體外製造了 PGC，然後將它們轉移到一隻白化病老鼠的卵巢中。由此產生的卵子在體外受精，並植入代孕母體內。“我知道它成功了，”當他看到幼崽深色的眼睛穿透它們半透明的眼瞼時，他說。
豐富的生殖細胞
其他研究人員已經能夠複製該過程以產生實驗室培養的 PGC（儘管《自然》雜誌聯絡的任何人都未曾使用它們來產生活的動物）。人工 PGC 對研究表觀遺傳學的科學家尤其有用：表觀遺傳學是對 DNA 的生化修飾，這些修飾決定了哪些基因被表達。這些修飾——最常見的是向單個 DNA 鹼基新增甲基——在某些情況下，會攜帶一種生物體所經歷的（例如，在子宮內暴露於外來化學物質）歷史記錄。與它們在其他細胞中的工作方式類似，表觀遺傳標記在胚胎髮育過程中推動 PGC 走向其命運，但 PGC 是獨一無二的，因為當它們發育成精子和卵子時，表觀遺傳標記會被擦除。這使得細胞能夠建立一個新的受精卵，該受精卵能夠形成所有細胞型別。
細微的表觀遺傳變化中的缺陷預計會導致不孕症和睪丸癌等疾病的出現。Surani 和 Hanna 的研究小組已經使用人工 PGC 研究單個酶在表觀遺傳調控中的作用，這可能有一天會揭示表觀遺傳網路如何參與疾病。
事實上，體外產生的 PGC 為科學家提供了數百萬個細胞進行研究，而不是透過解剖早期胚胎獲得的 40 個左右的細胞，Hanna 說。“這是一件大事，因為這裡我們有這些稀有細胞——PGC——它們正在經歷我們幾乎不瞭解的巨大全基因組表觀遺傳變化，”他說。“體外模型為科學家提供了前所未有的可及性，”Clark 同意道。
臨床意義
但是 Hayashi 和 Saitou 對那些懇求他們幫助的不孕夫婦幾乎無能為力。在將該協議用於臨床之前，還有很多問題需要解決。
齋藤和林發現，儘管他們技術產生的後代通常看起來健康且具有生育能力，但這些後代反過來產生的原始生殖細胞（PGC）並不完全“正常”。第二代 PGC 通常會產生脆弱、畸形，有時甚至會從支援它們的細胞複合物中脫落的卵子。當受精時，這些卵子經常分裂成具有三套染色體而不是正常兩套染色體的細胞，並且人工 PGC 成功產生後代的速率僅為正常體外受精（IVF）速率的三分之一。在馬薩諸塞州波士頓的哈佛醫學院研究表觀遺傳學的張毅（音譯）也一直在使用齋藤的方法，他發現體外 PGC 並不能像天然 PGC 那樣有效地清除其先前的表觀遺傳程式設計。“我們必須意識到這些是類 PGC 細胞，而不是 PGC，”他說。
此外，仍然存在兩個主要的技術挑戰。第一個是如何讓 PGC 在不移植回睪丸或卵巢的情況下轉化為成熟的精子和卵子；林正在試圖破譯卵巢和睪丸向 PGC 發出的訊號，這些訊號告訴它們變成卵子或精子，然後他可以將這些訊號新增到培養中的人工 PGC 中，以引導它們完成這些階段。
但最艱鉅的挑戰將是在人類身上重複小鼠 PGC 的工作。該小組已經開始使用齋藤確定在小鼠生殖細胞發育中重要的相同基因來調整人類誘導多能幹細胞（iPS細胞），但齋藤和林都知道，人類的訊號網路與小鼠的不同。此外，雖然齋藤有“無數”的活小鼠胚胎可供解剖，但該團隊無法獲得人類胚胎。相反，研究人員每週從附近的靈長類動物設施獲得 20 個猴子胚胎，這是一項為期五年、價值 12 億日元（1200 萬美元）的資助專案。林說，如果一切順利，他們可以在 5-10 年內在猴子身上重複小鼠的工作；經過細微調整後，該方法很快就可以用於產生人類 PGC。
但將 PGC 用於不孕症治療仍然是一個巨大的飛躍，許多科學家（包括齋藤）都在敦促謹慎。 iPS 細胞和胚胎幹細胞在培養過程中經常出現染色體異常、基因突變和表觀遺傳異常。“如果某些事情以微妙的方式出錯，可能會產生深遠的、多代的影響，”摩爾說。
證明該技術在猴子身上是安全的將有助於消除擔憂。但是，需要有多少健康的猴子出生才能認為該方法是安全的？應該觀察多少代？
最終，需要製造和測試人類胚胎，但創造胚胎用於研究的限制將減緩這一過程。新的、無創的成像技術將使醫生能夠以高度的準確性區分好壞胚胎。看起來類似於正常體外受精胚胎的胚胎可能會獲准植入人體。這可能會在私人資助或對胚胎研究持較少限制態度的國家發生。
當技術準備就緒時，甚至可能實現更具爭議性的生殖壯舉。例如，理論上可以使用男性皮膚細胞來製造卵子，這些卵子與伴侶的精子受精，然後在代孕者的子宮中培育。然而，有人懷疑這種壯舉是否可能實現——討論幹細胞倫理和挑戰的國際科學家聯盟欣克斯頓集團得出結論，很難從男性 XY 細胞中獲得卵子，並從女性 XX 細胞中獲得精子。“女性微環境提供給男性細胞的指令彼此不協調，”該聯盟成員克拉克說。
齋藤使用雄性小鼠的 iPS 細胞製造精子，並使用雌性小鼠的 iPS 細胞製造卵子，但他表示應該可以反過來進行。如果是這樣，可以產生來自同一只小鼠的卵子和精子，並用於受精，從而產生前所未有的東西：由自交創造的小鼠。林和齋藤都不準備嘗試這樣做。“只有當有充分的科學理由時，我們才會在（小鼠身上）這樣做，”齋藤說。現在他看不到這樣的理由。
這兩位科學家已經感受到來自患者和日本資助機構的壓力，要求他們向前推進。這項技術可能是那些體外受精無果的女性，或者那些童年患有癌症並失去產生精子或卵子能力的人的最後希望。林警告那些寫信給他的人，可行的不孕症治療可能還需要 10 年甚至 50 年的時間。“我的印象是它還很遙遠。我不想給人們不切實際的希望，”他說。
患者看到的是最終結果——在小鼠身上取得成功——並且經常忽略導致這種技術壯舉的多年艱苦工作。林說，他們沒有意識到，從小鼠轉向人類意味著幾乎要從頭開始。“人類早期胚胎與小鼠如此不同，以至於它幾乎就像‘重新開始一個花費了十多年’的過程。”