當我們中的兩人（蘭格和瓦坎蒂）在10年前最後一次為本雜誌撰寫關於組織工程前景的文章時，透過遵循工程原理並將非生物材料與細胞結合來“構建”活體組織的想法，對許多人來說聽起來仍然很奇妙。然而，對於可移植的人體組織以替代、恢復或增強器官功能的需求，過去是、現在仍然是迫切的。如今，美國有近 5000 萬人因各種形式的人工器官療法而得以存活，發達國家中每五個 65 歲以上的人中就有一個很可能在其餘生中受益於器官替代技術。
目前的器官替代技術，如全器官移植和腎透析機，已經挽救了許多生命，但它們是不完善的解決方案，給患者帶來了沉重的負擔。工程生物組織是可定製的和免疫相容的，因此有可能在器官衰竭患者的生活中產生重大影響。它們也可以滿足其他人類需求，例如，作為“晶片上的器官”用於測試候選藥物的毒性。
工程組織可以採取多種形式，從細胞聚集體或薄片到複雜的厚組織結構，以及最終的工程挑戰，即整個功能器官。自從我們最初提出建立這些可植入組織的障礙以來[參見 Robert S. Langer 和 Joseph P. Vacanti 合著的《組織工程：未來的挑戰》，《大眾科學》，1999 年 4 月]，科學家們已經取得了相當大的進展。皮膚替代品和軟骨替代品等產品已經幫助了成千上萬的患者。人工組織，如膀胱、角膜、支氣管和血管，正在進行臨床試驗。而構建更復雜組織結構的實驗室工作正在產生令人鼓舞的結果。
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儘管我們 10 年前描述的一些障礙仍然存在，但在過去十年中，從對人體在胚胎髮育和自然傷口癒合過程中自然構建組織方式的新見解中，取得了重大進展。組裝組織結構的工程方法也變得更加成熟，可用於此任務的材料的化學、生物和機械效能也變得更加成熟。因此，該領域正在走向成熟，組織工程產品正日益成為醫療的現實選擇。
輸送生命之血
皮膚和軟骨等組織成為首批准備進行人體測試的組織的原因之一是，它們不需要廣泛的內部脈管系統。但大多陣列織都需要，而提供血液供應的困難始終限制了工程組織的大小。因此，許多科學家專注於設計血管並將它們整合到工程組織中。
任何厚度超過幾百微米的組織都需要血管系統，因為組織中的每個細胞都需要足夠靠近毛細血管，以吸收不斷從這些微小血管中擴散出來的氧氣和營養物質。當被剝奪這些燃料時，細胞很快就會受到不可修復的損害。
在過去的幾年裡，人們設計了許多構建血管的新方法——既在組織外部，也在組織內部。許多技術依賴於對內皮細胞（形成毛細血管並排列較大血管的細胞）環境需求的更好理解，以及在極小尺度上雕刻材料的先進能力。例如，當將內皮細胞鋪設在腳手架材料床上時，該材料的表面圖案化有奈米級凹槽——是人類頭髮直徑的千分之一——它們被鼓勵形成毛細血管狀管網路[購買數字版以檢視相關側邊欄]。這些凹槽模仿了內皮細胞在形成天然血管時所靠的身體組織的紋理，從而提供了重要的環境訊號。
微細加工是一套用於蝕刻計算機和手機的微電子晶片的技術，也被用於製造毛細血管網路。例如，瓦坎蒂與馬薩諸塞州劍橋市德雷珀實驗室的傑弗裡·T·博倫斯坦合作，在可降解聚合物支架內直接生成了模仿組織毛細血管網路的微通道陣列。在這些通道內，可以培養內皮細胞以形成血管，同時也可以作為天然屏障，最大限度地減少血液對支架材料的汙染效應。另一種方法是使用膜過濾器將載血通道與組織構建體中的功能細胞分離[購買數字版以檢視相關側邊欄]。
另一種使細胞和血液分離但又足夠接近以交換各種分子的方法是將它們懸浮在水凝膠中，水凝膠是由聚合物的水合網路製成的凝膠狀材料。水凝膠在化學上類似於組織內所有細胞周圍的天然基質。功能細胞可以封裝在材料內部，並且穿過凝膠的通道可以用內皮細胞排列，以工程化具有原始脈管系統的組織樣結構。
耶魯大學勞拉·尼克拉森和蘭格實驗室的研究表明，透過將播種了平滑肌細胞和內皮細胞的支架暴露於生物反應器內的脈動條件下，可以生成較大的血管。在這種環境中製造的動脈被設計為模擬血液在體內血管中的流動，具有機械強度，並在移植到動物體內後仍能發揮功能。除了使組織工程師能夠將此類血管整合到更大的構建體中之外，工程管本身也可以為動脈粥樣硬化患者的搭橋手術提供移植物。
儘管在體外工程化毛細血管樣結構和較大血管的能力是一項重大突破，但如果構建體要存活，工作中的工程組織植入物必須迅速與接受者自身的血液供應連線。因此，誘導身體形成新的脈管系統是這項工作同樣重要的方面。例如，哈佛大學的戴維·穆尼已經證明，從聚合物微球或支架材料本身控制釋放化學生長因子可以促進血管的形成，從而穿透植入的組織構建體。
蘭格和瓦坎蒂所屬的 Pervasis Therapeutics 公司正在進行高階臨床試驗，其中將這一原理的一種變體應用於血管損傷的癒合。將含有平滑肌和內皮細胞的三維支架移植到損傷部位附近，以提供生長刺激訊號並促進受損血管的自然重建[購買數字版以檢視相關側邊欄]。
儘管取得了這些進展，但在製造大型血管化組織和血管移植物方面仍然存在許多挑戰，科學家們尚未完全解決這個問題。新的血管生長和滲透植入的組織構建體的速度很慢，導致許多構建體的細胞在植入後立即因缺乏血液供應而死亡。出於這個原因，包括在組織構建體內部預製血管系統的組織工程方法對於大型移植非常可能是必要的。這種預製血管也可以與血液血管募集生長因子的控制釋放相結合，以誘導構建體血管的進一步生長。
由於整合工程脈管系統和宿主脈管系統也至關重要，研究人員需要更好地瞭解宿主組織細胞和植入細胞之間的串擾，以促進它們的連線。這種破譯細胞彼此之間以及與其環境交換的更多訊號的需求也延伸到構建成功的組織植入物的其他方面，例如選擇最佳的生物原材料。
合適的細胞
在大多數情況下，從患者自身的細胞構建可植入組織將是理想的，因為它們與該人的免疫系統相容。實際上，此類植入物也可能面臨較少的監管障礙，因為該材料來源於患者自身的身體。然而，正常細胞在培養中繁殖的能力是有限的，這使得難以生成足夠的組織用於植入。來自患者自身身體或捐贈者的所謂成體幹細胞在某種程度上更多產，並且可以從許多來源分離出來，包括血液、骨骼、肌肉、血管、皮膚、毛囊、腸道、大腦和肝臟。
然而，成體幹細胞——它存在於成體組織中，並且能夠產生多種細胞型別，這些細胞型別是其天然組織的特徵——難以識別，因為它們看起來與普通細胞沒有太大區別。因此，科學家必須尋找獨特的表面蛋白質，這些蛋白質充當分子標記來標記幹細胞。識別額外的標記物將大大簡化在組織工程應用中與成體幹細胞合作的工作。幸運的是，在過去的幾年裡，已經取得了許多重大進展，包括開發分離細胞和誘導它們在培養中增殖和分化成各種組織型別的新方法。
值得注意的是，賓夕法尼亞大學的克里斯托弗·陳和丹尼斯·迪舍都證明，通常來源於肌肉、骨骼或脂肪的間充質幹細胞將對來自周圍環境的機械線索作出反應。已經證明，它們會分化成最類似於其生長的基質材料的剛度的組織。其他研究人員也表明，來自基質和周圍環境的化學訊號對於指導成體幹細胞分化成一種或另一種組織型別非常重要。然而，科學家們對於成體幹細胞是否能夠產生其自身組織家族以外的細胞存在分歧——例如，間充質幹細胞是否可以產生肝細胞。
與成體幹細胞相比，胚胎幹 (ES) 細胞易於在培養中擴增，並且可以分化成人體所有細胞型別。蘭格與以色列理工學院（位於海法）的舒拉米特·萊文伯格及其同事一起證明，甚至可以在組織工程支架上直接使 ES 細胞分化成所需的組織型別。這種能力表明有可能直接從分化的 ES 細胞在支架上製造 3-D 組織。然而，這些細胞確實存在各種挑戰。
將 ES 細胞均勻分化成所需的細胞型別仍然非常困難。為了模仿 ES 細胞複雜的自然微環境並最佳化它們的分化，研究人員正在同時測試許多條件，以找到來自不同材料和基質化學物質的正確線索組合。他們還在篩選各種小分子以及訊號蛋白，以識別控制“乾性”的因素——細胞在保持自身未分化狀態的同時產生分化後代的能力，隨時準備根據需要產生更多新細胞。
這些見解也可以應用於生產具有胚胎細胞能力但缺點較少的細胞。除了剛才概述的困難之外，科學家仍然無法預測移植的幹細胞在患者體內的行為。例如，未分化的 ES 細胞會形成腫瘤，如果細胞在移植前未全部成功分化，則會產生癌症風險。此外，研究人員一直在努力解決從人類胚胎中獲取 ES 細胞相關的倫理問題，方法是探索從非胚胎來源生產 ES 樣細胞的方法。
在過去的幾年裡，在從常規成體身體組織（如皮膚細胞）生產 ES 樣細胞方面取得了顯著進展。這些經過改造的細胞，稱為誘導多能幹 (iPS) 細胞，正在成為 ES 細胞令人興奮的替代品，作為組織工程的可再生資源。2007 年，當時在京都大學的山中伸彌*和威斯康星大學麥迪遜分校的詹姆斯·A·湯姆森首次表明，透過重新啟用一些被認為構成乾性基礎的遺傳途徑，可以將成體組織細胞轉化為原始 iPS 狀態。
例如，將少至四個主要調控基因重新引入成體皮膚細胞，就會導致細胞恢復到原始胚胎細胞型別。早期的實驗使用病毒將這些基因插入細胞，這種技術對於用於患者的組織來說太危險了。最近的研究表明，可以調整一種更安全的非病毒技術來啟用相同的乾性基因庫，甚至啟用單個調控基因可能就足夠了。該領域的快速進展使組織工程師充滿希望，患者自身的細胞，被賦予 ES 細胞能力，可能很快就會成為構建組織構建體的理想材料。即使在我們試驗這些不同細胞型別的同時，組織工程師也在改進我們的構建方法。
建築學進展
十年前，研究人員假設細胞是聰明的：如果我們把正確的細胞型別彼此靠近放置，它們就會“弄清楚”如何形成它們的天然組織。在某種程度上，這種方法是有效的，但我們現在更欣賞器官和組織發育以及正常功能期間細胞及其周圍環境之間交換的訊號的複雜性，並且我們知道在我們的構建體中提供定製環境的重要性。
此外，身體中的每個組織都執行工程替代物必須能夠執行的特定任務，我們正在學習儘可能緊密地複製相關組織的潛在生物學對於生成能夠執行其預期功能的組織至關重要。在更復雜的器官中，多種細胞型別協同工作——例如，在肝臟中，細胞的工作包括解毒和營養分解。因此，必須在組織工程構建體中重新建立組織的微觀結構和細胞相對於彼此的定位，以重現所需的功能。
早期的組織工程工作使用由各種材料製成的支架來嘗試複製組織的 3-D 形狀，並粗略地近似這種空間細胞組織。過去幾年中的許多進展提高了工程組織的複雜程度，並更緊密地再現了組織環境。例如，已經透過去除天然組織中的所有細胞來製造支架，僅留下結締組織纖維。這些外殼可用於生長工程組織，這些組織可以重新建立原始組織的很大一部分功能。在一項特別令人印象深刻的研究中，用心臟細胞和內皮細胞播種的脫細胞齧齒動物心臟支架產生了心臟肌肉纖維和血管結構，這些結構生長成跳動的心臟。
各種“列印”技術也可以用於精確排列細胞。透過修改標準噴墨印表機，工程師可以分配細胞本身或支架材料，以生成組織或細胞可以在其上播種的框架。模仿組織的自然地形也有助於引導細胞，另一種從工程世界借用的技術，靜電紡絲，可以生產類似於天然組織基質紋理的支架。紡制非常細的聚合物纖維以形成網狀支架，這為細胞提供了更自然的 3-D 環境，並且可以精細地控制聚合物材料的化學和機械特性。塔夫茨大學的戴維·卡普蘭用類似於蜘蛛網的絲綢材料製成了類似的支架，以生成韌帶和骨組織。
由於水凝膠的生物、化學和機械特性可以很容易地控制，因此凝膠被證明可用於支援和包裹細胞，同時增強所得組織的功能。含有活細胞的水凝膠可以“列印”或以其他方式排列和分層，以描繪正確的組織結構。例如，我們中的一位（卡德姆侯賽尼）已經表明，水凝膠包裹的細胞聚集體可以模製成任意數量的互補形狀[購買數字版以檢視相關側邊欄]，然後彙集在一起以自組織成更大的複雜圖案。這種技術可用於複製組織（如肝臟）中細胞的自然組織，肝臟由六邊形結構組成，每個六邊形結構都包含圍繞中央血管的毒素過濾細胞。
一些凝膠的設計使其聚合物響應紫外線而連線在一起，從而可以雕刻所需的構建體形狀，然後透過將構建體的全部或部分暴露於光線下使其固化。科羅拉多大學博爾德分校的克里斯蒂·安塞思和約翰霍普金斯大學的詹妮弗·埃利塞夫使用這種光交聯水凝膠生成了軟骨和骨組織。凝膠也可以注入許多訊號分子，以促進組織生長或分化。西北大學的塞繆爾·斯圖普已經表明，神經幹細胞在水凝膠內分化成神經元，該水凝膠包含充當環境訊號的小蛋白質，指導細胞的行為。斯坦福大學的海倫·M·布勞也使用了含有細胞外基質成分的水凝膠來控制和研究單個幹細胞的特性。
最後，奈米技術已被用於生成適用於移植的工程細胞片。東京女子醫科大學的岡野輝夫已經生產出塗有溫度響應聚合物的表面，當溫度從 37 攝氏度降至 20 攝氏度時，該聚合物會膨脹。首先誘導細胞在這些奈米工程表面上形成單層，然後降低溫度以膨脹下面的基質並分離完整的細胞片。然後可以將這些細胞片（包含適當的細胞分泌基質分子）堆疊或捲起來以構建更大的組織構建體。
儘管這些進展大大改進了可以生成的支架的範圍和多樣性，但該領域仍然存在挑戰。一個困難是缺乏對各種組織發育和傷口癒合特定階段存在的生長因子和細胞外分子濃度和組合的瞭解。需要更好地瞭解這些設計引數，以工程化模仿身體自身癒合和發育的組織。因此，組織工程師正在向其他領域尋求見解，包括對發育組織和再生傷口中基因和蛋白質相互作用的研究。將這些發現與先進的培養系統相結合，正在幫助我們更好地控制體外細胞的反應，但還需要取得更多進展。
走向成熟
儘管存在我們已經描述的持續挑戰，但工程組織不再是虛幻的前景。簡單的製造組織已經投入臨床使用，這種恢復或替代生物功能的方法現在有望成為數百萬有需要的患者的可行療法。截至 2008 年底，各種組織工程產品的年銷售額接近 15 億美元。
鑑於在我們上次為本雜誌撰寫關於組織工程前景的文章後不久該領域遭受的挫折，這些數字更加令人印象深刻。在 1990 年代末和 2000 年代初期，熱情和投資都很高，但隨著網際網路金融泡沫的破裂，生物技術初創企業的資金減少了。即使是擁有食品和藥物管理局 (FDA) 批准的組織工程產品的公司，也必須重組其商業模式，推遲其產品上市。由於工程組織由細胞、生物活性化學物質和非生物支架材料製成，因此構建體必須經過 FDA 的嚴格分析，這既昂貴又耗時。資金的缺乏使公司更難進行廣泛的臨床試驗。具有諷刺意味的是，某些組織工程產品的商業化延遲有一個好處——它為科學成熟和商業方法變得更加成熟贏得了時間。
仍然有改進的空間。獲得 FDA 批准仍然是一個主要障礙，部分原因是來自不同人的細胞可能表現不同，並且接受者對同一種植入物的反應也可能不同。這種不可預測性可能使 FDA 難以確定給定的工程構建體是安全有效的。因此，進一步的研究對於衡量和理解個體之間的差異，並在研究組織工程產品的臨床試驗中考慮這些差異非常重要。未來的商業模式必須包括與這項工作相關的廣泛成本。
儘管如此，憑藉最近對組織如何發育以及身體如何自然修復自身的見解，組織工程師現在正致力於創造第二代產品，這些產品在機械、化學和功能上都比以往任何時候都更接近其生物對應物。即使在當今緊張的經濟環境下，我們預計對奈米技術、幹細胞生物學、系統生物學和組織工程的研究將很快融合，為設計當今如此多的人需要的複雜器官替代物產生新的想法。
這篇文章最初以“組織工程進展”為標題印刷
*注（2009 年 4 月 21 日）：自發布以來，山中伸彌的名字拼寫已更正。