螢火蟲在體內產生化學反應，使其能夠發光。這種發光方式稱為生物發光。螢火蟲產生光的方法可能是最著名的生物發光例子。當氧氣與鈣、三磷酸腺苷 (ATP) 和化學物質熒光素在熒光素酶（一種生物發光酶）存在下結合時，就會產生光。與燈泡在產生光的同時會產生大量熱量不同，螢火蟲的光是“冷光”，不會以熱量的形式損失大量能量。這是必要的，因為如果螢火蟲的發光器官變得像燈泡一樣熱，螢火蟲就無法在那種體驗中存活下來。
螢火蟲透過將氧氣新增到產生光所需的其他化學物質中來控制化學反應的開始和結束，從而控制其光發射的開始和停止。這發生在昆蟲的發光器官中。當有氧氣時，發光器官會亮起，當沒有氧氣時，光會熄滅。昆蟲沒有肺，而是透過一系列複雜的、逐漸變小的稱為氣管的小管，將氧氣從體外輸送到體內的細胞內。長期以來，考慮到控制氧氣運輸的肌肉速度相對較慢，一些螢火蟲物種如何設法實現如此高的閃光頻率一直是一個謎。研究人員最近發現，一氧化氮氣體（與服用藥物偉哥產生的氣體相同）在螢火蟲的閃光控制中起著至關重要的作用。簡而言之，當螢火蟲的光“熄滅”時，沒有產生一氧化氮。在這種情況下，進入發光器官的氧氣會與細胞的能量產生細胞器（稱為線粒體）的表面結合，從而無法在發光器官內進一步運輸。一氧化氮的存在（與線粒體結合）允許氧氣流入發光器官，在那裡與產生生物發光反應所需的其他化學物質結合。由於一氧化氮分解得非常快，一旦不再產生這種化學物質，氧分子就會再次被線粒體捕獲，並且無法用於產生光。
螢火蟲發光的原因似乎有很多。幼蟲會發出短促的光，主要在夜間活動，儘管許多物種是地下或半水生的。螢火蟲在體內產生防禦性類固醇，使其對捕食者來說難以下嚥。幼蟲使用它們的光芒作為警告展示，以傳達它們的令人厭惡的味道。成年後，許多螢火蟲都具有各自物種獨有的閃光模式，並利用它們來識別其物種的其他成員以及區分異性成員。多項研究表明，雌性螢火蟲會根據特定的雄性閃光模式特徵來選擇配偶。在兩個不同的螢火蟲物種中，較高的雄性閃光頻率以及增加的閃光強度已被證明對雌性更具吸引力。
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然而，某些物種的成年螢火蟲根本不發光，而是使用資訊素來尋找配偶。在螢火蟲中，使用資訊素作為性訊號似乎是祖先的狀態，而使用發光的性訊號則是較新的發展。有些物種在其交配系統中同時使用資訊素和發光成分。這些物種似乎是僅使用資訊素的螢火蟲和僅使用閃光的螢火蟲之間的進化中間體。