在10年前舉行的一場正面交鋒的競賽中，美國國立衛生研究院的科學家測試了兩種有前景的新型疫苗，以觀察哪種疫苗可能對地球上最致命的病毒之一，即導致艾滋病的HIV（人類免疫缺陷病毒）提供最強的保護。其中一種疫苗由稱為質粒的DNA環組成，每個質粒攜帶五種HIV蛋白質之一的基因。其目標是讓接受者的自身細胞製造病毒蛋白，希望它們能激起免疫細胞的保護性反應。第二種疫苗沒有使用質粒，而是使用了另一種稱為腺病毒的病毒作為單一HIV基因的載體，該基因編碼一種病毒蛋白。這種組合的基本原理是使用一種“安全”病毒來引起免疫細胞的注意，同時引導它們對HIV蛋白產生反應。
我們中的一位（韋納）已經研究DNA疫苗八年了，並希望能夠充分證明質粒誘導針對可怕病原體免疫力的能力。然而，測試結果對第一代DNA疫苗的信徒造成了重大打擊。DNA接受者對五種HIV蛋白僅表現出微弱的免疫反應或根本沒有反應，而基於腺病毒的疫苗的接受者則有強烈的反應。對於學術界和製藥公司的研究人員來說，腺病毒顯然看起來是開發HIV疫苗更有力的候選者。
對於DNA疫苗研究人員來說，結果並非完全出乎意料，因為在之前的一些試驗中已經觀察到不良反應。儘管如此，這些失敗還是令人失望的，因為我們有充分的理由期望質粒疫苗既安全又有效。科學家們確信最初的概念仍然有力，因此回到繪圖板，尋找提高該技術有效性的方法。現在，這些努力開始獲得回報。新一代基於質粒的疫苗在人體和動物試驗中證明，它可以在產生預期反應的同時，保持DNA如此吸引人的安全性和其他優點。相同的DNA技術現在也擴充套件到其他形式的免疫療法和藥物的直接遞送。成熟形式的此類DNA疫苗和療法有望透過解決目前缺乏有效治療的多種疾病而取得成功。
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過去和現在的好主意
當20世紀90年代初利用DNA為人類免疫的概念開始受到關注時，其優雅的簡潔性立即顯而易見。疫苗的核心成分——構建用於攜帶編碼來自一種或多種病原體的蛋白質的基因的質粒——會誘導接受者的細胞製造這些蛋白質，但不會攜帶製造整個病原體的指令，因此疫苗不會產生病原體本身。
當質粒進入宿主細胞（稱為轉染）時，通常解碼DNA的機制開始讀取質粒的基因並製造所需的蛋白質，蛋白質最終從細胞中釋放出來，很像病毒顆粒。在細胞外，病原體特異性蛋白質被免疫細胞識別為外來物質。因此，免疫系統應該被欺騙，認為身體被感染，從而引發針對外來蛋白質的長期免疫識別和反應。僅僅引入攜帶一個基因的DNA環就可以誘導免疫力，從而抵抗整個病原體。
除了安全性和簡便性之外，DNA疫苗還具有優於其他型別疫苗的許多優點。它們的生產速度明顯快於某些傳統疫苗，例如需要處理和培養“活”病毒且生產過程至少需要四到六個月的流感疫苗。DNA在室溫下本質上是穩定的（這對我們的細胞來說很幸運），因此DNA疫苗不需要持續冷藏，這在許多疫苗的運輸和儲存過程中是一個令人擔憂的問題。
從疫苗設計者的角度來看，DNA還有另一個優點，近年來，這個優點在重新開啟這項技術的大門方面發揮了重要作用。免疫系統不會將質粒視為外來物質——畢竟，它們是由DNA製成的——因此疫苗本身在技術上不會引起任何免疫反應。只有質粒基因編碼的蛋白質，一旦由細胞製造出來，才會引起免疫哨兵的注意，這意味著質粒可以一次又一次地在同一接受者中使用，以遞送多種基因，而無需擔心身體會對DNA載體產生免疫力並攻擊疫苗本身。
不幸的是，在早期的DNA疫苗測試中，免疫反應微弱的問題是一個重大缺陷。這些失敗的主要原因似乎是疫苗質粒沒有進入足夠的細胞，而且即使進入了細胞，細胞也沒有產生足夠多的編碼蛋白質。結果，免疫系統沒有得到充分的刺激。
然而，競爭技術最終將面臨更大的問題。2007年，製藥公司默克啟動了一項大型HIV疫苗試驗，該疫苗使用一種稱為AdHu5的腺病毒來遞送HIV病毒基因。鑑於之前使用腺病毒的實驗中觀察到的強烈免疫反應，人們對這項名為STEP試驗的開始抱有很大的希望和興奮。總共有大約3000名HIV陰性個體接受了疫苗或安慰劑注射。
然而，隨著試驗的進行，兩組之間開始出現令人不安的差異：接種疫苗的人的保護效果並不比接受安慰劑的人好，最終他們似乎更容易感染HIV。早期統計發現，疫苗組914名男性中有49人感染了HIV，而安慰劑組922名男性中有33人感染了HIV。意識到這一點後，STEP試驗於2009年夏天被停止。資料仍在分析中，以尋找造成這種情況的線索，但一些證據表明AdHu5載體可能是其中一個可能的混淆因素。在對AdHu5（一種常見的感冒病毒）具有預先存在免疫力的人群中，免疫系統可能攻擊了疫苗本身。為什麼一些疫苗接受者似乎更容易感染HIV仍然不清楚。
DNA的重生
在STEP試驗之前的幾年裡，仍然堅信DNA平臺潛力的研究人員一直在努力開發解決方案，以解決第一代質粒疫苗的複雜問題。這些努力的重點是提高質粒活性的所有方面，包括將它們匯入細胞的新方法、提高它們進入細胞後蛋白質產量的新方法，以及增強免疫系統對疫苗編碼蛋白質反應的疫苗新增劑。
新的疫苗遞送方法是這項工作中最重大的成就之一，因為它們使更多細胞——包括免疫細胞本身——吸收質粒。例如，透皮貼劑和其他無針系統，如Gene Gun和Bioject，它們使用加壓空氣注射疫苗，將質粒遞送到皮膚中，在那裡，稱為抗原呈遞細胞的免疫哨兵高度集中。這些方法還比針頭注射將質粒物理性地強行匯入更多細胞。為了在使用針頭注射到肌肉或皮膚中的疫苗中獲得類似的結果，注射後可以進行電穿孔，這是一系列電脈衝，可使細胞膜暫時開啟孔隙，使質粒更容易進入。電穿孔可以將細胞對質粒的吸收量提高多達1000倍。
質粒-基因構建體本身也透過對其攜帶基因的DNA序列進行多種型別的改進而得到改進。例如，密碼子最佳化涉及以細胞最容易執行的方式拼寫基因的指令。在遺傳密碼中，蛋白質的氨基酸構建塊由構成密碼子的三組DNA“字母”指定。某些氨基酸由多個密碼子指定，但細胞通常偏愛其中一個同義密碼子，並且比其他密碼子更有效地翻譯它。因此，選擇最佳密碼子可以提高細胞產生所需蛋白質的產量。對基因序列的其他修改可以提高細胞實際讀取以製造蛋白質的信使RNA基因轉錄本的穩定性和準確性，並可以加快蛋白質的製造速度。
基因起始附近的一個所謂的引導序列是細胞首先翻譯成蛋白質分子起點的序列，最佳化基因的引導序列可以提高最終蛋白質分子的穩定性。某些引導序列甚至可以將蛋白質標記為細胞應該分泌的蛋白質，這是理想的，因為它允許免疫細胞在轉染細胞內部和外部都遇到外來蛋白質。這兩種情況會引發略微不同的免疫反應型別，並且這種組合增強了疫苗產生的整體免疫力。
最後一項重要的改進涉及稱為佐劑的物質，佐劑通常新增到傳統疫苗中以增強免疫系統反應。在某些情況下，如果需要，佐劑甚至可以將免疫系統引導到一種形式的反應而不是另一種形式的反應，例如，傾向於更多地產生T細胞（T細胞在體內尋找並殺死病原體感染的細胞），而不是更多地產生抗體蛋白（抗體蛋白試圖阻止病原體進入細胞）。例如，一種名為Vaxfectin的化合物已被證明可以將針對流感的DNA疫苗的抗體反應提高200倍。另一種佐劑——Resiquimod——與某些DNA疫苗一起使用，以引發包括T細胞和抗體的強烈免疫反應。
基於DNA的技術的另一個引人注目的方面是，設計者可以將佐劑分子的基因直接整合到疫苗質粒中，而不是將佐劑新增到最終疫苗製劑中，這有時會引起人們對保持製劑的適當乳化或穩定性的擔憂。吸收質粒的細胞隨後將與疫苗蛋白一起製造編碼的佐劑。當基因編碼的佐劑被新增到DNA疫苗中時，即使質粒已經按照之前的描述進行了最佳化，佐劑也可以進一步將免疫反應提高五倍或更多。
這些設計者質粒疫苗與DNA平臺早期簡單的蛋白質編碼構建體截然不同。憑藉最佳化的質粒和改進的遞送方法，該技術已準備好在STEP試驗開始時捲土重來。更重要的是，DNA方法已經開始顯示出超越經典疫苗接種的用途前景，包括質粒遞送某些藥物和針對癌症的免疫療法。
多用途技術
安全地將基因遞送到細胞中並讓這些細胞有效地製造編碼蛋白質的能力為許多潛在的治療方法開闢了道路。事實上，在廣泛臨床應用競賽中，這些基於DNA的療法中的許多療法都領先於DNA疫苗。與通常以小化學分子形式出現的經典藥物不同，DNA療法遞送基因來治療疾病。然而，與傳統的基因療法不同，質粒不會永久整合到接受者的細胞基因組中，甚至不會永久保留在細胞中，這避免了阻礙基因療法進展的併發症。
與新技術通常的情況一樣，基於質粒的療法最早的成功是在動物身上。一個已經獲得許可用於豬的例子旨在預防胎兒流失。與電穿孔一起施用於懷孕母豬的質粒進入母豬的細胞，然後細胞產生一種激素（生長激素釋放激素），該激素支援妊娠胎兒的存活。這種治療方法的成功部分令人興奮，因為它只需要單次注射即可在如此大的動物身上起作用，這對人類療法來說是個好兆頭。
目前正在進行各種大型人類DNA療法臨床試驗，包括一項遞送稱為生長因子的蛋白質基因的試驗，這些蛋白質動員幹細胞來治療充血性心力衰竭。另一項試驗採用編碼稱為IGF-1的生長因子的質粒來治療患有X連鎖重症聯合免疫缺陷症的患者的生長障礙。第三項試驗解決了一個眾所周知的難以治療的迴圈系統問題，稱為危重肢體缺血。該療法遞送質粒編碼因子，誘導新血管生長，以期避免截肢的需要。
另一類稱為DNA生物免疫療法的治療方法，結合了DNA療法和疫苗的最佳方面，透過遞送誘導身體對現有疾病（如腫瘤或慢性病毒感染）產生免疫反應的基因。例如，一項早期試驗使用DNA編碼病毒蛋白，以誘導免疫細胞攻擊由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的腫瘤。該試驗的初步結果表明，一半的接受者能夠對HPV蛋白產生T細胞反應，超過90%的接受者產生高水平的抗體。目前正在進行的另一項試驗正在測試針對丙型肝炎病毒的DNA免疫療法。這兩項試驗令人鼓舞的初步結果意義重大，因為目前尚無針對HPV腫瘤或丙型肝炎的有效免疫療法。
在這個領域，獸醫應用再次比人類研究更先進，一種成功的犬黑色素瘤DNA療法讓研究人類癌症的研究人員感到興奮。梅里亞爾公司生產的犬黑色素瘤療法，與未治療的犬相比，晚期黑色素瘤犬的中位生存時間延長了六倍。這種DNA生物免疫療法證明了新一代DNA平臺有潛力在以前的方法未能成功的地方取得成功。
回到未來
在過去的10年中，已經進行或正在進行數十項人類DNA療法和疫苗的臨床試驗。流感疫苗的質粒版本例證了DNA方法已經證明的一些好處。我們研究小組開發的一種流感疫苗，目前正處於早期人體試驗階段，在動物實驗中被證明可以抵抗常見的流感病毒株以及已感染數百人的高致命性H5N1禽流感。該疫苗能夠提供如此廣泛的保護，是因為其質粒包含所謂的流感病毒基因共有序列，這意味著由此產生的病毒蛋白類似於許多不同流感病毒株的病毒蛋白。此類疫苗可能意味著季節性流感疫苗與每年出現的新流感病毒株之間不匹配的終結。
當然，去年出現的新型H1N1流感病毒株引發了全球大流行，凸顯了對新型疫苗方法的迫切需求。製藥公司Vical製造的實驗性DNA版H1N1疫苗於2009年5月僅用兩週時間完成。如果這種疫苗提前經過測試和獲得許可，則至少可以比標準疫苗上市早兩個月大量生產。目前該疫苗正處於早期人體試驗階段，結果令人鼓舞。
DNA疫苗和療法靶向其他有效替代療法的疾病的潛在能力，也使DNA重新回到HIV疫苗競賽中。目前正在人體試驗中的一種疫苗Pennvax-B包含三種HIV病毒基因以及編碼佐劑分子的基因，並透過電穿孔遞送。還有兩種疫苗正在一項策略中進行測試，該策略使用質粒來啟動免疫細胞識別HIV蛋白，然後施用另一種疫苗型別以將早期免疫反應提高到更高水平。其中一種疫苗GeoVax，正在與一種基於稱為改良痘苗病毒安卡拉的病毒的疫苗一起給予作為加強劑。具有諷刺意味的是，美國國立衛生研究院疫苗研究中心現在正在測試一種不同的基於DNA的HIV疫苗，並使用兩種基於腺病毒的HIV疫苗之一作為加強劑。
幾種DNA疫苗和療法已經用於動物，並且正在進行涉及難以治療的疾病的大型、後期人體試驗，這一事實證明了質粒技術已經取得了多大的進步。過去十年該領域的巨大進步已經將一些最具創造性的疫苗和療法帶入臨床測試，以造福人類。在這方面，我們這些自這項技術誕生之初就對其進行培育的人不禁感到自豪，看到它已經擺脫了艱難的童年，並且可以期待光明的未來。