就像人們透過 Twitter、Facebook 和 LinkedIn 分享新聞一樣，細胞也利用多種資訊交換模式。有些細胞釋放激素，透過血液廣泛傳播；另一些細胞釋放神經遞質，在神經元之間傳遞訊號。但幾乎所有細胞，事實證明，都透過大量的通道與鄰居建立網路，這些通道直接連線一個細胞的內部和下一個細胞的內部。
20世紀60年代中期，研究人員戲劇性地瞥見了這種細胞間通訊的形式，當時他們將熒光染料分子注入到密密麻麻的細胞群中的單個細胞中。透過顯微鏡觀察，他們看到熒光從一個細胞迅速擴散到下一個細胞，直到有時組織中數百個細胞都發出光芒。之前的研究表明，離子可以在相鄰細胞之間傳遞電訊號。但是，觀察到染料分子的擴散（染料分子很小，但比離子大），無疑證實了細胞擁有通道，分子可以透過這些通道在相鄰細胞之間大量傳遞。
生物學家現在知道這些通道無處不在。它們大量存在於所有動物（包括人類）的組織中，在那裡它們參與了各種各樣的功能。這些集合，稱為間隙連線，有助於同步心臟肌肉細胞的跳動和分娩時子宮的收縮。間隙連線使眼睛能夠適應不同的光照水平。它們甚至在胚胎髮育過程中的器官形成中也發揮作用。
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在過去的20年裡，科學家們發現間隙連線的組裝或活動缺陷會導致一系列人類疾病，包括聽力喪失、白內障、皮膚病、神經系統疾病、心臟病甚至某些癌症。影響內耳間隙連線組成蛋白的單個突變導致高達 40% 的遺傳性耳聾患者出現聽力喪失。並且與間隙連線相關的新的疾病一直在被發現——僅在過去幾年中就發現了幾種，包括一種兒童癲癇。
現在，研究正在為間隙連線的構建方式提供令人興奮的見解，並且它們開始揭示間隙連線組裝和活動的破壞如何引發疾病。這些發現應該為許多疾病帶來新的療法，這些疾病是由於細胞無法再共享“內部”資訊而導致的。
搭建橋樑
早在早期的染料注射實驗進行時，研究人員並沒有從醫學相關性的角度進行思考。在 20 世紀 60 年代和 70 年代，他們專注於揭示更多關於細胞之間這種神秘的鄰居到鄰居的通訊的證據，並更多地瞭解其特性。在間隙連線被識別和命名之前，生理學家發現這種分子資訊的共享發生在各種器官和生物體中，從魷魚胚胎和電魚到各種哺乳動物細胞。他們證實，分子確實在細胞膜緊密物理接觸的點上直接在細胞之間移動。
到 20 世紀 60 年代後期，科學家們的目標是確定通道的外觀以及它們如何形成。早期的顯微鏡研究表明，在兩個相鄰細胞的膜緊密貼合的地方存在大的、扁平的斑塊。在這些連線處，細胞之間似乎被一個非常薄的間隙隔開，只有幾奈米寬，這導致該結構被稱為間隙連線。即使在研究人員發現這個狹窄的空間並非空曠，而是充滿了連線一個細胞到另一個細胞的通道的部分之後，這個名稱仍然沿用至今。
為了探索這些扁平膜斑塊在染料和電學實驗中看到的“細胞連線性”中所起的作用，我們中的一位（Johnson）開始研究這些連線組裝時會發生什麼。約翰遜與他在明尼蘇達大學的同事一起，輕輕地將源自肝腫瘤的培養細胞分離，然後將它們重新混合在一起。幾分鐘之內，扁平的斑塊出現在細胞膜上，但僅出現在兩個細胞接觸的地方。這一觀察證實了一種懷疑，即間隙連線的組裝是一個聯合專案，需要相鄰細胞的合作。隨著這些扁平斑塊的擴充套件和成熟，細胞之間透過的電流也增加了。這些連線似乎可以促進離子的交換。
約翰遜和他的團隊剝離了連線細胞的膜以進行仔細觀察，看到了似乎是大量顆粒積聚在扁平斑塊內。後來證明，這些顆粒是構成間隙連線的基石的通道。每個通道都由稱為連線蛋白的分子形成，連線蛋白屬於 20 世紀 80 年代後期鑑定出的一類蛋白質。
六個連線蛋白結合在一起形成一個稱為半通道的甜甜圈狀結構。這個半通道被插入到細胞的外膜中，在那裡它可以與相鄰細胞中的半通道相互作用。當這些匹配的半通道中的連線蛋白相互作用時，它們形成一個連續的孔，以一種方式連線細胞，使一個細胞的細胞質與另一個細胞的細胞質直接通訊。實際上，這個孔是單個間隙連線通道，數百或數千個通道聚集在一起形成每個間隙連線。
構建這些巨大的通訊集團對細胞來說是一項龐大的任務。單個間隙連線可以包含 10,000 個通道。由於每個間隙連線通道都涉及兩個半通道，因此每個連線總共需要 120,000 個連線蛋白。僅心臟就包含數十億個細胞，每個細胞都透過間隙連線與其幾個鄰居相互作用。換句話說，這些龐大結構的組裝是分子工程的奇蹟。
更令人驚奇的是，間隙連線不是永久性的，甚至不是長壽命的，而是不斷地被拆卸和重建。研究表明，心臟間隙連線中一半的連線蛋白每兩小時更換一次。在一天的時間裡，人體心臟中的每個間隙連線很可能都被拆除並替換為新組裝的通道。
鑑於這些非凡結構的複雜性，似乎必須存在系統來確保它們的構建順利進行，以便細胞間通訊不會丟失。為了掌握這些調控機制，我們三個人都在研究間隙連線，選擇結合我們的專業知識；特別是，我們想探索如何控制這些廣泛的通訊通道的組裝和移除。
走到一起
我們在加利福尼亞州太平洋格羅夫的阿西洛瑪會議中心舉行的間隙連線會議上喝咖啡時，制定了我們的合作計劃。那是 1991 年，我們中的一位（Lampe）是約翰遜在明尼蘇達大學實驗室的博士後研究員，那裡的重點已轉向間隙連線組裝的調控。我們三人組的最後一位成員（Laird），當時是加州理工學院 Jean-Paul Revel 實驗室的博士後，剛剛開發出一組抗體分子，這些分子特異性地結合連線蛋白。這些抗體將使我們能夠與連線蛋白相互作用，並瞭解分子的哪些部分對於間隙連線的形成和活動至關重要。
萊爾德的抗體識別出一種特殊的連線蛋白：Cx43。人類擁有編碼 21 種不同連線蛋白的基因，每種細胞型別都產生自己獨特的連線蛋白組。皮膚細胞雄心勃勃地製造多達九種不同的連線蛋白。然而，Cx43 是該家族中最廣泛的成員，存在於許多器官中，包括皮膚、心臟、大腦、肺和骨骼。
像所有連線蛋白一樣，Cx43 由四個跨膜片段組成，這些片段將蛋白質錨定在細胞膜中。蛋白質的尾部懸掛在細胞內部，包含各種元素，我們稍後將確定這些元素參與調節其活性和組裝成通道和連線。蛋白質在膜中進出時形成的兩個環突出到細胞之間的空間中。萊爾德產生的一些抗體靶向這些細胞外片段。
由於環從細胞表面伸出，因此認為它們可能充當類似魔術貼的鉤子，使連線蛋白能夠相互鎖定，這似乎是合理的。為了檢查這個假設，我們再次分離培養的細胞，然後將它們重新混合在一起——但這次我們添加了萊爾德的抗體。現在間隙連線根本沒有形成；我們沒有看到注射染料的細胞間轉移，也沒有看到發展中間隙連線的特徵性扁平斑塊。透過粘附在環上，抗體阻止了一個細胞中的連線蛋白與相鄰細胞中的連線蛋白“對接”。
此類抗體研究表明，連線蛋白的附著對於間隙連線的構建至關重要。但是，需要一種不同的技術來即時觀察連線蛋白在活細胞中的移動過程。
追蹤蛋白質
1994 年，我們三個人發現自己再次聚在一起參加另一次會議——這次是在舊金山舉行的美國細胞生物學學會會議。在關於我們聽到的演講的深夜聊天中，我們對綠色熒光蛋白 (GFP) 越來越興奮——這是一種分子工具，其有用性最終將獲得諾貝爾獎的認可。會議上的一位演講者描述了她如何將這種熒游標記物連線到她最喜歡的蛋白質上，以追蹤其在活細胞中的運動。因此，我們想知道我們的研究小組是否可以使用 GFP 來監測連線蛋白的運動。
我們首先將 GFP 貼在連線蛋白的尾端。令我們非常高興的是，這種方法效果很好：標記的連線蛋白被正確地插入細胞膜中，在那裡它們組裝成功能性間隙連線，這些連線表現出幾乎所有由未修飾的連線蛋白構建的連線的特性。我們現在有一種強大的方法來觀察細胞內連線蛋白的行為——萊爾德在他的新職位上繼續在西安大略大學進行這項工作。
我們的最初觀察結果令人驚訝。我們最初每 10 分鐘拍攝一次包含標記連線蛋白的細胞的圖片，認為我們可以將這些靜止影像拼接在一起製作成延時電影，突出顯示連線蛋白的運動。但是連線蛋白移動得太快了，以至於我們無法分辨哪個蛋白質是哪個蛋白質，或者每個蛋白質去了哪裡。我們每兩分鐘再次嘗試，但這個時間範圍仍然不夠好。為了觀察單個標記的分子在細胞周圍移動，我們最終不得不每隔幾秒鐘收集影像。
由此產生的電影使我們不僅能夠追蹤連線蛋白，還能夠觀察半通道，因為它們沿著由稱為微管的結構組成的分子軌道在細胞內運輸。我們和其他人看到，較小的間隙連線可以結合形成較大的間隙連線——我們在電子顯微鏡研究中已經獲得了一些暗示。我們還證明，較大的間隙連線可以分解形成較小的間隙連線，這是一種間隙連線重塑，發生在細胞生長、移動、彎曲和分裂時。
我們的同事設計了更多標記連線蛋白的方法，發現間隙連線透過在其周界新增半通道而生長——因此間隙連線的中心部分代表斑塊的“最老”部分。這些較舊的成分似乎隨著間隙連線的老化而被移除，這種觀察結果可以解釋間隙連線如何在其中連線蛋白丟失的情況下仍然存在；較新的通道向內擁擠以取代較舊的通道。
我們活細胞研究中最引人注目的發現也許是，當參與細胞之一基本上咬掉其鄰居的一部分時，間隙連線也可以大塊地被細胞回收，這是其他人根據一些早期的電子顯微鏡影像提出的機制。這種激進的操作會吞噬由兩個細胞貢獻的連線元件——這個過程可能提供一種安全可靠的方法，可以在不再需要時快速關閉兩個細胞之間的通訊。這種大規模消除間隙連線實際上發生在分娩後的子宮中，從而停用了已形成以協調收縮的通訊網路。
掌控
瞭解到間隙連線不斷更新，我們接下來著手探索細胞如何監督這種大規模的分子重塑。早期的研究表明，稱為激酶的蛋白質是調節劑。透過簡單地向目標蛋白質新增磷酸基團，激酶可以改變該蛋白質的活性或在細胞內的位置。
我們的挑戰是弄清楚蛋白質激酶是否也調節連線蛋白的行為，如果是這樣，磷酸化究竟起什麼作用。當 Lampe 於 1994 年在西雅圖的弗雷德·哈欽森癌症研究中心建立他的實驗室時，他在這一系列研究中發揮了主導作用。透過分解 Cx43 並一次檢查蛋白質的一小部分，Lampe 和他的同事發現，在其生命週期中，這種連線蛋白在其尾部多達 15 個不同的位置被磷酸化。這些資訊使我們能夠找出控制含有 Cx43 的間隙連線形成的一些調控密碼。當特定的激酶作用於蛋白質尾部的某些部分時，這種修飾會增強含有 Cx43 的連線的組裝；作用於尾部不同部分的其他激酶會抑制連線的形成、活性或大小。
對調控密碼的深入瞭解現在使我們能夠檢查人體組織樣本，以尋找磷酸化變化如何改變間隙連線在損傷或疾病期間的組裝和功能的線索。例如，我們和其他人已經開始確定，當心髒細胞試圖從心臟病發作後的缺氧中恢復時，或者當皮膚細胞動員起來以癒合傷口或劃痕時，透過間隙連線的通訊如何變化。在這兩種情況下，Lampe 的團隊都發現 Cx43 尾部的一個特定位點的磷酸化作用增強。這種磷酸化作用透過阻止 Cx43 與一種蛋白質（其他小組研究過）相互作用來短暫地增加這些組織中間隙連線的大小，該蛋白質限制了新連線蛋白整合到現有連線中的能力。間隙連線大小的由此增加有助於增加通訊——這在損傷後的最初幾分鐘內至關重要——並有助於保持心臟組織的功能並促進閉合開放性傷口所需的皮膚細胞的遷移。
瞭解磷酸化如何影響連線蛋白的組裝和功能，以及間隙連線通訊如何響應損傷或疾病而變化，這為開發可以促進或抑制相關蛋白激酶活性的療法打開了一扇門。然而，必須謹慎地追求此類治療策略，因為在疾病的某個階段增加間隙連線可能在後期被證明是有害的。例如，儘管間隙連線在損傷後立即短暫增大，但隨後它們會被迅速降解以促進適當的癒合。在患有糖尿病的人中，Cx43 的持續過度產生會延緩傷口閉合。當角膜被劃傷時，連線蛋白會促進炎症和疤痕形成，而不是癒合。在這些情況下，限制損傷周圍細胞中 Cx43 的產生或功能可促進傷口快速修復而無疤痕——幾種生物技術公司正在追求這種方法。
然而，為了充分利用我們對間隙連線生物學的知識來設計有效的療法，研究人員需要更深入地瞭解連線蛋白如何在不同條件下在不同組織中聚集在一起，以及它們的聚集和活動如何在面對疾病時出錯。對編碼連線蛋白的基因中致病突變的研究開始提供一些有用的見解。
中斷通訊
研究人員在 20 世紀 90 年代中期發現了連線蛋白可以參與疾病的第一個確鑿的遺傳證據。發現 Cx32 編碼基因中的突變會導致一種稱為 Charcot-Marie-Tooth 病的神經系統疾病。在這種疾病中，神經髓鞘中絕緣神經的間隙連線消失，導致髓鞘退化並導致神經退化；反過來，這種喪失會導致肌肉萎縮和虛弱，尤其是在四肢。
隨著連線蛋白基因中的突變具有嚴重的生理後果的發現，間隙連線領域見證了研究人員和臨床醫生對確定這些疾病的遺傳基礎的興趣激增。其他研究發現了新的連線蛋白突變，如今已知 14 種不同的疾病源於間隙連線連線蛋白的缺陷。
關於這一系列疾病最引人注目的事情是它們彼此之間的差異有多大。除了神經退行性 Charcot-Marie-Tooth 病外，連線蛋白中的突變還可能導致聽力喪失、癲癇、心臟病、皮膚病、白內障和胚胎髮育過程中出現的各種疾病。正如可能預期的那樣，不同連線蛋白中的突變會導致不同的疾病。但是，在一個更令人驚訝的發現中，事實證明突變型連線蛋白不一定平等地影響所有組織或器官；如果在兩個器官中產生特定的突變體，它可能會損害一個器官的功能，但不會損害另一個器官的功能。
許多研究小組正在努力理解這種現象。一種解釋可能是，在某些組織中，其他健康的連線蛋白可以補償缺陷變體，從而使間隙連線通訊以足夠的水平繼續進行。這種補償機制可能發生在某些組織中，但不會發生在其他組織中。或者，也許特定的連線蛋白在一個組織中發揮一種作用，但在其他組織中發揮不同的作用，這取決於存在哪些其他連線蛋白。各種連線蛋白家族成員也可以混合，產生混合通道，這些通道可以促進不同分子訊號的傳遞——其中一些訊號在一個組織中比在另一個組織中更重要。
然而，對於某些連線蛋白，缺陷確實會損害多個組織。以我們研究的一種疾病為例，稱為眼齒指發育不良 (ODDD)。患有這種疾病的人，由 Cx43 基因突變引起，表現出一系列症狀，包括小眼睛、牙齒髮育不良、面部和頭部的骨骼畸形以及手指或腳趾之間的蹼狀物。似乎這還不夠，一些受影響的人會發展出一種皮膚病，這種皮膚病會在手掌和腳底產生增厚、鱗狀的老繭。最近對連線蛋白生命週期的研究為解釋為什麼有些人比其他人患有更嚴重的疾病形式提供了一些暗示。
在 ODDD 患者中發現了 70 多個 Cx43 突變，我們首先探索這些突變對蛋白質的作用——以及它們如何影響間隙連線的構建。萊爾德和他的同事發現，Cx43 基因中的許多突變導致連線蛋白到達細胞膜，但不會形成功能性間隙連線；染料不會透過這些連線從細胞到細胞流動，這表明間隙連線通道要麼沒有正確組裝，要麼不允許分子訊號透過。無論哪種方式，這些突變都會減少細胞間通訊。
其他 ODDD 突變阻止連線蛋白到達細胞膜。攜帶這些突變的患者通常患有更嚴重的疾病，包括皮膚病以及其他缺陷。這一發現表明，連線蛋白半通道可能除了在構建間隙連線中發揮作用外，還有其他工作，並且當這項工作未完成時——就像連線蛋白從未到達細胞膜時發生的那樣——會出現更嚴重的問題。例如，也許一些半通道沒有配對形成通道，而是保持未耦合狀態，從而允許細胞釋放訊號或從其環境中吸收分子。這些分子可能與通常透過間隙連線通道的分子不同。這種半通道活性已透過實驗得到證明，為我們理解連線蛋白在細胞通訊中所起的作用增加了一個新的維度。對突變型半通道的進一步研究可能會揭示新的靶點——包括尚未確定的透過未耦合半通道的分子——用於治療 ODDD 或其他基於連線蛋白的疾病。
講述秘密
研究突變如何影響間隙連線的構建和行為也可能導致高度靶向的療法，這些療法可以抵消突變的影響，而不會引發嚴重的、不必要的副作用。例如，瞭解特定的突變會改變間隙連線的組裝——但不會改變連線蛋白向細胞表面的運輸——可能會為一種藥物指明方向，該藥物可能會恢復連線蛋白形成功能性通道的能力。這種靶向療法可以提供一種重建細胞間通訊的方法，而無需完全替換突變型連線蛋白——這個過程將涉及基因療法，這仍然是一種有風險且實驗性的方法。
在連線蛋白中發現致病突變不僅提供了有希望的治療靶點。它還為研究人員提供了一套新穎的工具來研究間隙連線的基本生物學。例如，我們仍然不完全瞭解透過間隙連線在細胞之間傳遞的特定分子。在心臟細胞的情況下，我們知道透過間隙連線流動的離子在細胞之間傳遞電訊號。但是，我們幾乎不知道在細胞之間傳遞什麼以支援例如耳朵中的聽覺器官的功能或皮膚中的傷口癒合反應。透過觀察連線蛋白通道在不同細胞中的行為方式，以及它們組裝和活動的變化如何引發疾病，我們最終將能夠解決關於這種親密的細胞通訊形式的最基本問題：細胞之間究竟在竊竊私語什麼，這些分子秘密如何支配複雜生物體（包括我們自己）的組裝和運作？