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（編者注：本文最初發表於《大眾科學》雜誌2005年1月刊。我們釋出這篇文章是因為與豬流感相關的最新訊息。）
1918年9月7日，正值第一次世界大戰高峰期，波士頓郊外一個陸軍訓練營的一名士兵因發高燒來到醫務室。醫生診斷他患有腦膜炎，但在第二天，當十幾名士兵因呼吸道症狀住院時，他們改變了主意。16日又出現了36例這種不明疾病的新病例。令人難以置信的是，到9月23日，在這個45,000名士兵的營地中，已報告了12,604例病例。到疫情結束時，該營地三分之一的人口將患上這種嚴重疾病，其中近800人將死亡。死去計程車兵常常出現藍色的皮膚顏色，並在窒息死亡前可怕地掙扎。許多人在症狀出現後不到48小時就死亡了，屍檢時發現他們的肺部充滿了液體或血液。
由於這一系列不尋常的症狀與任何已知的疾病都不符，當時著名的病理學家威廉·亨利·韋爾奇推測“這一定是某種新型感染或瘟疫”。然而，這種疾病既不是瘟疫，甚至也不是新的。它只是流感。儘管如此，這種特別具有毒性和傳染性的流感病毒株據信在1918年至1919年間在全球範圍內造成多達4000萬人死亡。
這場現代歷史上最致命的流感爆發幾乎像它出現時一樣迅速消失，其病因長期以來被認為已淹沒在時間的長河中。沒有人儲存病原體的樣本以供日後研究，因為直到20世紀30年代，流感才被確定為病毒。但由於美國陸軍醫學博物館令人難以置信的遠見卓識、一位名叫約翰·胡爾丁的病理學家的堅持，以及對舊組織樣本進行基因分析的進展，我們已經能夠檢索到1918年病毒的部分片段並研究其特徵。現在，在1918-1919年可怕的自然災害發生80多年後，從少數受害者身上回收的組織正在解答關於這種大流行毒株的性質以及關於流感病毒的一般運作方式的基本問題。
這項努力不僅僅是出於歷史好奇心。由於流感病毒不斷進化，新的流感毒株不斷威脅著人類 population。自1918年以來，大流行性人類流感病毒已經出現過兩次——分別在1957年和1968年。通常只感染動物的流感毒株也 периодически 在人類中引起疾病，正如最近在亞洲爆發的禽流感所見。我們的兩個主要目標是確定是什麼使1918年的流感如此致命，以指導流感治療和預防措施的開發，並確定大流行病毒的起源，以更好地鎖定未來大流行毒株的可能來源。
追尋1918年病毒
在許多方面，1918年的流感大流行與之前和之後的其他流感大流行相似。每當一種新的流感毒株出現，其特徵是大多數人的免疫系統從未遇到過的，就可能發生廣泛的流感爆發。但1918年大流行的某些獨特特徵長期以來仍然令人費解。
例如，它的廣度和深度都非常突出。疫情席捲歐洲和北美，遠至阿拉斯加荒野和太平洋最偏遠的島嶼。最終，世界人口的三分之一可能受到感染。這種疾病也非常嚴重，死亡率為2.5%至5%——高達其他流感爆發死亡率的50倍。
到1918年秋季，歐洲每個人都稱這種疾病為“西班牙”流感，可能是因為中立的西班牙沒有像交戰國那樣對疫情新聞實施戰時審查。這個名字流傳了下來，儘管大流行的第一次爆發，或稱春季浪潮，似乎在1918年3月在美國的軍營及其周圍地區出現。全球大流行的第二次主要浪潮發生在1918年9月至11月，在許多地方，1919年初又一次嚴重的流感浪潮來襲。
抗生素尚未被發現，大流行期間死亡的大多數人死於機會性細菌引起的肺炎，這些細菌感染了那些已經因流感而虛弱的人。但一部分流感受害者在症狀出現後幾天就死於更嚴重的病毒性肺炎——由流感本身引起——這導致他們的肺部大量出血或充滿液體。此外，大多數死亡發生在15至35歲的年輕人中，這個群體很少死於流感。引人注目的是，在1918-1919年，65歲以下的人佔所有“超額”流感死亡人數（高於正常年平均水平）的99%以上。
瞭解1918年大流行的原因及其不尋常特徵的努力幾乎在疫情結束後立即開始，但罪魁禍首病毒本身仍然隱藏了近八十年。1951年，來自愛荷華大學的科學家，包括一位最近從瑞典來的名叫約翰·胡爾丁的研究生，遠赴阿拉斯加的蘇厄德半島尋找1918年的毒株。1918年11月，流感在五天內蔓延到一個現在被稱為佈雷維格米申的因紐特人漁村，造成72人死亡——約佔成年人口的85%。他們的屍體此後一直埋在永久凍土中，1951年探險隊的成員希望在受害者的肺部找到儲存下來的1918年病毒。不幸的是，所有從這些標本中培養活流感病毒的嘗試都失敗了。
1995年，我們小組開始嘗試使用不同的組織來源尋找1918年的病毒：在武裝部隊病理研究所 (AFIP) 存檔的屍檢標本。幾年來，我們一直在開發從受損或腐爛的組織中提取脆弱的病毒遺傳物質以用於診斷目的的專業知識。例如，1994年，我們能夠利用我們的新技術幫助一位AFIP海洋哺乳動物病理學家調查一起被歸咎於赤潮的大規模海豚死亡事件。儘管可用的海豚組織樣本嚴重腐爛，但我們從其中提取了足夠的RNA片段，以鑑定出一種新的病毒，類似於引起犬瘟熱的病毒，這被證明是海豚死亡的真正原因。很快，我們開始想知道，我們研究所的資源是否可以解決任何更古老的醫學謎團。
AFIP是1862年成立的美國陸軍醫學博物館的後裔，隨著病理學醫學專業的成長而發展，現在收藏了三百萬個標本。當我們意識到這些標本包括1918年流感受害者的屍檢樣本時，我們決定追蹤這種大流行病毒。我們的初步研究檢查了1918年秋季致命浪潮中78名受害者的組織樣本，重點關注那些具有嚴重肺損傷特徵的快速死亡患者。由於流感病毒通常在感染後幾天內清除肺部，我們有最大的機會在這些受害者身上找到病毒殘餘。
當時的 стандартная практика 是將屍檢標本儲存在甲醛中，然後將其包埋在石蠟中，因此從這些80年前的“固定”組織中分離出微小的病毒遺傳片段，將我們開發的技術推向了極限。經過令人痛苦的一年無果而終，我們在1996年找到了第一個流感陽性樣本，這是一個1918年9月在南卡羅來納州傑克遜堡去世計程車兵的肺部標本。我們能夠確定來自該樣本的五個流感基因的小片段中的核苷酸序列。
但是為了確認這些序列屬於致命的1918年病毒，我們繼續尋找更多的陽性病例，並在1997年又發現了一例。這位士兵也於1918年9月在紐約州厄普頓營去世。擁有第二個樣本使我們能夠確認我們已有的基因序列，但是從這些屍檢中剩餘的少量組織使我們擔心，我們永遠無法生成完整的病毒序列。
1997年，一個意想不到的來源為我們的問題提供瞭解決方案：約翰·胡爾丁，當時是一位73歲的退休病理學家，他讀到了我們的初步結果。他主動提出返回佈雷維格米申，再次嘗試挖掘埋在永久凍土中的1918年流感受害者。在他第一次嘗試46年後，在佈雷維格米申委員會的許可下，他獲得了四名流感受害者的冷凍肺活檢樣本。在其中一個樣本中，來自一位年齡不明的女性，我們發現了流感RNA，這為1918年病毒的整個基因組測序提供了關鍵。
最近，我們的小組與英國同事合作，也一直在調查來自倫敦皇家醫院的1918年流感受害者的屍檢組織樣本。我們已經能夠分析來自其中兩例病例的流感病毒基因，並發現它們與北美樣本幾乎相同，證實了一種統一病毒在全球範圍內的快速傳播。但是，這些序列能告訴我們關於1918年毒株的毒力和起源的什麼資訊呢？回答這些問題需要一些關於流感病毒如何發揮作用並在不同宿主體內引起疾病的背景知識。
流感多變的面孔
過去100年中引起大流行的三種新型流感毒株都屬於A型流感病毒組。流感主要有三種形式，分別標記為A、B和C。後兩種僅感染人類，從未引起大流行。另一方面，A型流感病毒已被發現感染多種動物，包括家禽、豬、馬、人類和其他哺乳動物。水禽，如鴨子，是所有已知亞型A型流感的天然“宿主”，這意味著該病毒感染鳥類的腸道而不會引起症狀。但是，這些野生禽類毒株會隨著時間的推移發生變異，或與其他流感毒株交換遺傳物質，從而產生能夠在哺乳動物和家禽中傳播的新型病毒。
A型流感病毒的生命週期和基因組結構使其易於進化和交換基因。該病毒的遺傳物質由八個獨立的RNA片段組成，這些片段包裹在鑲有蛋白質的脂質膜中。為了繁殖，病毒結合並進入活細胞，在那裡它徵用細胞機制，誘導其製造新的病毒蛋白和病毒RNA的額外複製。然後，這些片段自行組裝成新的病毒，這些病毒逃離宿主細胞，繼續感染其他細胞。沒有校對機制確保RNA複製的準確性，因此導致新突變的錯誤很常見。更重要的是，如果兩種不同的流感病毒毒株感染同一個細胞，它們的RNA片段可以在那裡自由混合，產生後代病毒，其中包含來自兩種原始病毒的基因組合。病毒基因的這種“重配”是產生多樣化新毒株的重要機制。
不同的迴圈A型流感病毒透過參考其表面的兩種標誌性蛋白質來識別。一種是血凝素 (HA)，它至少有15種已知的變體或亞型。另一種是神經氨酸酶 (NA)，它有九個亞型。暴露於這些蛋白質會在宿主體內產生獨特的抗體，因此1918年毒株是第一個被命名為“H1N1”的毒株，這是基於在大流行幸存者的血液中發現的抗體。事實上，毒性較低的H1N1後代一直是主要的迴圈流感毒株，直到1957年，H2N2病毒出現，引起了一場大流行。自1968年以來，H3N2亞型（引發了當年的大流行）佔據了主導地位。
給定A型流感病毒上存在的HA和NA蛋白質亞型不僅僅是識別符號；它們對於病毒繁殖至關重要，並且是受感染宿主免疫系統的主要目標。HA分子透過與某些宿主細胞表面的受體結合來啟動感染。這些受體往往是哺乳動物的呼吸道內壁細胞和鳥類的腸道內壁細胞。NA蛋白使新的病毒複製能夠逃離宿主細胞，以便它們可以繼續感染其他細胞。
宿主首次接觸HA亞型後，抗體將在未來阻止受體結合，因此非常有效地防止再次感染同一毒株。然而，對人類來說是新的HA亞型的流感病毒 периодически 出現，最有可能透過與感染野生鳥類的廣泛流感病毒庫重配。通常，適應於禽類宿主的流感HA與人類呼吸道中普遍存在的細胞表面受體的結合不良，因此禽類病毒的HA結合親和力必須經過一定程度的修改，病毒才能在人類中有效複製和傳播。直到最近，現有的證據表明，完全的禽流感病毒可能無法直接感染人類，但在1997年香港有18人感染了禽類H5N1流感病毒，其中6人死亡。
一種更具致病性的H5N1毒株的爆發在2003年和2004年在亞洲家禽中變得普遍，在越南和泰國，超過30人感染了這種病毒並已死亡。流感病毒一旦感染宿主，其毒力取決於一系列複雜的因素，包括病毒進入不同組織的容易程度、其複製速度以及宿主對入侵者的免疫反應的強度。因此，準確瞭解是什麼使1918年大流行流感毒株如此具有傳染性和毒力，可以為了解是什麼使任何流感毒株更具威脅性或威脅性較小提供重要的見解。
致命殺手的面孔
透過我們檢索到的1918年RNA，我們已經使用病毒自身的基因作為配方來製造其組成部分——本質上是重建致命病毒自身的部分片段。我們渴望檢查的第一個部分是血凝素蛋白，以尋找可能解釋1918年毒株異常毒力的特徵。
例如，我們可以看到，1918年HA中與宿主細胞結合的部分與完全禽流感HA的結合位點幾乎相同。在1918年的兩個分離株中，該受體結合位點與禽類形式僅相差一個氨基酸構建塊。在其他三個分離株中，第二個氨基酸也發生了改變。這些看似細微的突變可能代表了允許禽類HA與哺乳動物類受體結合所需的最小變化。
但是，雖然獲得新的結合親和力是病毒感染一種新型宿主的關鍵步驟，但這並不一定能解釋為什麼1918年毒株如此致命。我們轉向基因序列本身，尋找可能與毒力直接相關的特徵，包括其他流感病毒中的兩個已知突變。其中一個涉及HA基因：為了在細胞中變得活躍，HA蛋白必須被宿主提供的腸道特異性蛋白切割酶或蛋白酶切割成兩部分。一些禽類H5和H7亞型病毒獲得了一種基因突變，該突變在切割位點添加了一個或多個鹼性氨基酸，從而允許HA被普遍存在的蛋白酶啟用。在雞和其他鳥類中，感染這種病毒會導致多個器官甚至中樞神經系統疾病，死亡率非常高。目前在亞洲傳播的H5N1病毒中已觀察到這種突變。然而，我們在1918年的病毒中沒有發現它。
另一個對毒力有顯著影響的突變已在感染小鼠的兩種流感病毒毒株的NA基因中觀察到。同樣，單個氨基酸的突變似乎允許病毒在許多不同的身體組織中複製，並且這些流感毒株通常對實驗室小鼠是致命的。但我們在1918年病毒的NA中也沒有看到這種突變。由於對1918年病毒基因的分析沒有揭示任何可以解釋其極端毒力的特徵，我們與其他幾個機構發起了一項合作努力，以重建1918年病毒本身的部分片段，以便我們可以觀察它們在活組織中的作用。
一種稱為基於質粒的反向遺傳學的新技術使我們能夠複製1918年的病毒基因，然後將它們與現有流感毒株的基因結合起來，從而產生一種雜交病毒。因此，例如，我們可以採用一種適應小鼠的流感毒株，併為其提供不同組合的1918年病毒基因。然後，透過用這種工程病毒感染活體動物或人體組織培養物，我們可以看到大流行毒株的哪些成分可能是其致病性的關鍵。
例如，1918年病毒產生對上下呼吸道組織快速而廣泛損害的獨特能力表明，它複製到大量並從細胞到細胞迅速傳播。已知病毒蛋白NS1可阻止I型干擾素 (IFN) 的產生——I型干擾素是細胞用於啟動針對病毒感染的免疫反應的“早期預警”系統。當我們在人體肺細胞的組織培養物中測試重組病毒時，我們發現具有1918年NS1基因的病毒確實更有效地阻斷了宿主的I型IFN系統。
迄今為止，我們已經產生了含有1918年基因中一到五個的重組流感病毒。有趣的是，我們發現任何擁有1918年HA和NA基因的重組病毒都對小鼠是致命的，引起了類似於一些大流行死亡病例中看到的嚴重肺損傷。當我們分析這些肺組織時，我們發現了參與常見炎症反應的基因啟用的特徵。但我們也發現了高於正常水平的與免疫系統的攻擊士兵、T細胞和巨噬細胞相關的基因啟用，以及與組織損傷、氧化損傷和細胞凋亡或細胞自殺相關的基因啟用。
最近，威斯康星大學麥迪遜分校的川岡義裕報告了在小鼠中使用1918年流感基因進行的類似實驗，結果相似。但是，當他分別測試HA和NA基因時，他發現只有1918年HA產生了強烈的免疫反應，這表明，由於一些尚不清楚的原因，這種蛋白質可能在1918年毒株的毒力中發揮了關鍵作用。
這些正在進行的實驗正在為過去開啟一扇窗戶，幫助科學家瞭解1918年大流行的不尋常特徵。同樣，這些技術將用於研究當前H5N1禽流感毒株的哪些型別的變化可能使這種極具致命性的病毒有可能在人類中引起大流行。一個同樣引人入勝的問題是，如此高毒力的毒株最初是如何出現的，因此我們的小組也一直在分析1918年病毒的基因，以尋找關於其可能起源的線索。
尋找來源
分析流感病毒之間關係的最佳方法是系統發育學，即使用病毒基因序列和關於基因典型突變頻率的知識構建假設的家族樹。由於流感病毒的基因組由八個可以透過重配獨立移動的離散RNA片段組成，因此必須對每個基因片段分別進行這些進化研究。
我們已經完成了對1918年病毒八個RNA片段中的五個片段的分析，到目前為止，我們將1918年流感基因與眾多人類、豬和禽流感病毒的基因進行比較，總是將1918年病毒置於人類和豬科系中，而不是禽類病毒組之外。然而，1918年病毒基因確實具有一些禽類特徵，因此病毒最初可能在1918年之前的某個時候從禽類宿主中出現。但顯然到1918年，該病毒已經獲得了足夠的哺乳動物適應性，可以作為人類大流行病毒發揮作用。問題是，在哪裡？
當我們分析1918年血凝素基因時，我們發現該序列與禽類序列的差異比1957年H2和1968年H3亞型更多。因此，我們得出結論，要麼1918年HA基因在中間宿主體內花費了一段時間，在那裡它從原始禽類序列中積累了許多變化，要麼該基因直接來自禽類病毒，但該病毒與已知的禽類H1序列明顯不同。
為了調查禽類H1基因可能在1918年大流行後的八十年裡發生了重大變化的後一種可能性，我們與史密森學會國家自然歷史博物館和俄亥俄州立大學的科學家合作。在檢查了那個時代的許多儲存下來的鳥類後，我們的小組從1917年收集並在史密森學會鳥類收藏中用乙醇儲存的一隻黑雁中分離出了一種禽類亞型H1流感毒株。事實證明，1917年的禽類H1序列與現代北美禽類H1毒株密切相關，這表明禽類H1序列在過去80年中變化不大。對更多野生鳥類H1毒株進行廣泛測序可能仍會鑑定出一種更類似於1918年HA的毒株，但可能找不到類似於1918年毒株的禽類H1，因為事實上，HA並沒有直接從鳥類毒株重配而來。
在那種情況下，它一定有一些中間宿主。豬是一個被廣泛提出的可能性，因為眾所周知，豬對人類和禽類病毒都易感。事實上，在1918年大流行期間，人類和豬都出現了同步的流感爆發，但我們認為傳播方向最有可能從人類到豬。自1918年以來，有許多人類A型流感病毒毒株感染豬的例子，但豬流感毒株僅 периодически 從人類中分離出來。儘管如此，為了探索1918年HA可能最初是一種禽類形式，逐漸適應豬等哺乳動物宿主的可能性，我們研究了禽類病毒在豬體內進化的當前例子——一種禽類H1N1流感譜系，該譜系在過去25年中已在歐洲豬體內建立。我們發現，即使在豬體內進化了20年，也沒有導致1918年大流行毒株所表現出的與禽類序列的差異數量。
當我們將這些型別的分析應用於其他四個1918年病毒基因時，我們得出了相同的結論：引發1918年大流行的病毒很可能是一種禽類毒株，它在進化上與典型的野生水禽流感基因庫隔離了一段時間——一種像SARS冠狀病毒一樣，從一個尚未知曉的動物宿主進入人類迴圈的病毒。
未來的研究
我們對1918年病毒的五個RNA片段的分析為了解其起源提供了一些線索，並強烈表明，大流行病毒是隨後的所有人和豬H1N1譜系的共同祖先，而不是從豬中出現的。迄今為止，對病毒基因的分析尚未提供關於1918年病毒毒株異常毒力的明確線索。但是，使用含有1918年基因的工程病毒進行的實驗表明，某些1918年病毒蛋白可能促進病毒的快速複製並引發強烈的破壞性宿主免疫反應。
在未來的工作中，我們希望可以將1918年大流行病毒毒株置於緊隨其前後的流感病毒的背景下進行研究。大流行病毒的直接前體，即第一次或春季浪潮病毒毒株，缺乏秋季浪潮的異常毒力，並且似乎傳播性較差。目前，我們正在尋找來自春季浪潮受害者的流感RNA樣本，以鑑定兩種毒株之間的任何基因差異，這可能有助於闡明為什麼秋季浪潮更為嚴重。同樣，找到1918年之前的人類流感RNA樣本將闡明1918年病毒中的哪些基因片段對人類來說是完全新的。如果該病毒與早期傳播的毒株具有共同特徵，而老年人對這些毒株具有一定的免疫力，則可能解釋1918年大流行期間年輕人異常高的死亡率。並且找到1920年代及以後的H1N1樣本將有助於我們瞭解1918年病毒隨後演變成毒力較低形式的過程。
我們必須記住，大流行流感毒株起源的機制尚未完全瞭解。由於1957年和1968年的大流行毒株具有禽類樣HA蛋白，因此最有可能的是它們起源於禽類和人類病毒毒株的直接重配。然而，這些重配事件的實際情況從未被確定，因此沒有人知道新型毒株發展成人類大流行需要多長時間。
1918年大流行毒株更加令人費解，因為其基因序列既不符合直接從已知禽類毒株重配，也不符合禽類毒株在豬體內的適應性。如果事實證明1918年病毒透過與隨後的的大流行毒株不同的機制獲得了新的基因，這可能會對公共健康產生重要影響。另一種起源甚至可能促成了1918年毒株的異常毒力。對更多禽流感病毒進行測序以及研究豬以外的其他中間宿主，如家禽、野生鳥類或馬，可能會為1918年大流行的來源提供更多線索。在更好地瞭解此類毒株的起源之前，檢測和預防工作可能會忽略下一次大流行的開始。