150 多年來，科學家們主要依靠化石化的骨骼和牙齒來重建遠古時代的生物。骨骼揭示了遠古動物的大小和形狀；骨骼上的肌肉痕跡表明這些生物有多強壯以及它們可能如何移動；牙齒的形狀和磨損證明了所吃食物的種類。總而言之，研究人員已設法從這些堅硬的部分中提取了大量的非凡資訊。在極少數情況下，他們偶然發現了儲存完好的木乃伊和冰凍的屍體，這使他們能夠在重建中新增更多細節，例如皮毛的長度、耳朵的形狀、動物最後一餐的具體內容。然而，儘管科學家們已經能夠從過去時代的生命形式的物理特徵中推斷出如此多的東西，但我們對維持它們的生理過程知之甚少。
然而，這種差距正在縮小。生物技術的最新進展現在使我們能夠重新組裝已滅絕動物的遠古基因，並復活這些基因編碼的蛋白質——這些蛋白質既形成又驅動著生命過程的細胞機制。這項工作預示著一門激動人心的新興科學學科的曙光：古生理學，即研究過去生物的身體在生命中如何運作。我們仍處於這項研究的早期階段，但我們已經對史前時代的一個標誌性野獸——猛獁象——如何適應冰河時代世界的殘酷條件有了驚人的見解。儘管克隆史前動物的侏羅紀公園夢想仍然遙不可及，但我們的工作已經證明了觀察發生在早已從地球表面消失的生物體內的關鍵生理過程的可行性。
懸案
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對於我們中的一位（坎貝爾）來說，這項事業的靈感始於 2001 年的一個晚上，當時他正在觀看一個電視節目，記錄從西伯利亞永久凍土中挖掘猛獁象遺骸的過程。鑑於 1997 年宣佈克隆綿羊多莉的事件廣為人知，節目中的專家推測——事實證明是錯誤的——來自這隻猛獁象的 DNA 可能很快就能讓科學家們讓這些生物重獲新生。坎貝爾自己的願景比這項極其複雜的企業更具針對性，並且最終更可行。他想弄清楚這些現今亞洲象的已滅絕近親是如何適應它們居住的高緯度地區的寒冷氣候的。
化石記錄表明，猛獁象的祖先起源於非洲的亞熱帶平原，直到不到兩百萬年前才遷徙到西伯利亞，當時地球正進入其歷史上最深刻的降溫事件之一：更新世冰期。與非洲象一樣，猛獁象祖先在其家園面臨的主要生理挑戰將是避免過熱。然而，一旦該譜系向北遷徙，世界變冷，保持體溫就變得至關重要。
由於我們對已滅絕物種生物學的所有了解幾乎都是從對其化石化、冰凍或木乃伊化的遺骸的詳細研究中推斷出來的，因此關於猛獁象適應寒冷的討論主要侷限於從回收的屍體中直接可觀察到的物理屬性，例如這些猛獁象因此得名的濃密羊毛底毛。然而，物理特徵只是故事的一部分——而且可能只是次要的一部分。事實上，一系列生理過程無疑對於它們在寒冷中生存至關重要。不幸的是，這些過程在化石記錄中沒有留下痕跡，因此我們研究它們的唯一希望是從遠古遺骸中回收破碎的 DNA 片段，將基因完整地拼湊在一起，將它們插入活細胞中，並誘導細胞重新創造曾經控制這些過程的蛋白質。然後，我們可以精確地觀察已滅絕動物的蛋白質與它們現存的近親相比是如何發揮作用的。
因此，坎貝爾使用儲存完好的 DNA 研究猛獁象適應寒冷的想法，雖然比實際復活這些野獸簡單幾個數量級，但仍然需要大量的精巧生物技術工作。幸運的是，遠古 DNA 研究的重大進展即將到來，這將有助於為實現他的目標鋪平道路。
即使在最好的情況下，長期死亡標本中的 DNA（如果已儲存下來）也以極小的量存在。它也高度片段化且佈滿化學損傷。活生物體的細胞包含兩種 DNA：細胞能量產生細胞器或線粒體中的簡單 DNA 環，以及細胞核中更復雜的 DNA。早期對遠古 DNA 的研究集中線上粒體變體上，因為它比核 DNA 豐富得多：每個細胞都有數百個線粒體，但只有一個細胞核。然而，線粒體 DNA 僅佔細胞中所有遺傳物質的極小一部分；它僅編碼少數蛋白質，所有蛋白質僅線上粒體中使用。真正的作用在於核 DNA。科學家最初認為，不可能回收足夠的遠古核 DNA 來進行研究。然而，1999 年，現在在柏林萊布尼茨動物園和野生動物研究所的亞歷克斯·格林伍德和他的同事報告說，他們在永久凍土遺骸中發現了證據，表明核 DNA 的小片段可以在數萬年內以足以進行分析的量存活。
儘管格林伍德的工作證明了從與猛獁象一樣古老的生物中獲得核序列的短片段（即包含多達 70 個核苷酸——遺傳密碼的“字母”）是可能的，但對構成每個完整基因的數百到數千個核苷酸進行測序仍然在很大程度上是不切實際的。此外，格林伍德的方法需要破壞大量來之不易的遠古 DNA。然而，透過借用分子生物學家用來從現存生物體中生成 DNA 多個複製的稱為多重 PCR 的技術，我們中的一位（霍夫萊特）提出瞭解決這些問題的方法，從而掃清了研究已滅絕生物體生理學的關鍵障礙。在他的第一個原理驗證中，他的研究團隊從冰河時代物種——猛獁象——組裝了第一個完整的線粒體基因組（一個 16,500 個核苷酸的序列），並在 2005 年發表了這一發現。
金髮女郎和紅髮女郎
在磨練了其遠古 DNA 測序技術後，霍夫萊特的德國萊比錫團隊隨後使用該技術重建了來自已滅絕物種的第一個完整核基因。DNA 的來源再次是一隻猛獁象，具體來說是哥本哈根大學的埃斯克·威勒斯列夫在西伯利亞北部發現的一塊儲存異常完好的 43,000 年曆史的股骨。該團隊選擇了一個名為黑素皮質素 1 受體 (MC1R) 的基因，已知該基因有助於確定鳥類羽毛和哺乳動物毛髮的顏色。MC1R 很有吸引力，因為它很短且易於插入細胞中，在細胞中可以測量其分子活性，使研究人員能夠將 DNA 序列與可觀察到的性狀聯絡起來。
鑑於從永久凍土儲存的猛獁象中回收的毛髮往往呈淺色或深色，霍夫萊特和他的合作者推測，基因功能的差異——而不是毛髮暴露於數萬年的沉積物中的化學因素——可能構成了這兩種不同毛髮顏色的基礎。對構成完整 MC1R 基因的所有 1,236 個核苷酸進行測序，揭示了兩個獨立的基因變體或等位基因。第一個等位基因與相應的非洲象基因在一個核苷酸上不同，而第二個等位基因包含三個額外的突變，所有這些突變都在產生的蛋白質中產生了氨基酸（蛋白質的組成部分）的取代。
儘管霍夫萊特和他的合作者很感興趣地發現，這些取代中的兩個發生在蛋白質中在進化過程中很少發生變化的位置，但在其他哺乳動物中缺乏可比的突變使得不可能衡量這些不尋常的替換是否影響了猛獁象的毛髮顏色。然而，對細胞中基因活性的分析表明，第二個等位基因中的三個突變之一產生了取代，從而使色素沉著基因的活性降低。從其他哺乳動物色素沉著基因的分子活性來判斷，這種較弱的變體可能有助於使一些猛獁象的皮毛變成金色。
非常巧合的是，當時在加州大學聖地亞哥分校的霍皮·霍克斯特拉和她的同事同時發現，一些現代沙灘鼠種群攜帶一種 MC1R 基因變體，該變體產生與第二個猛獁象等位基因中發現的相同的關鍵氨基酸交換。更重要的是，攜帶這種變體的小鼠具有淺色皮毛，這為它們棲息的沙質環境提供了天然偽裝。對於猛獁象來說，成為金髮女郎的好處遠沒有那麼明顯，因為金髮個體在原始西伯利亞的無樹景觀中仍然會非常顯眼。然而，可以想象的是，淺色的皮毛有助於這些動物在這個寒冷多風的環境中保持溫暖，正如對具有淺色的現存鳥類和哺乳動物所表明的那樣。這聽起來可能違反直覺，因為淺色毛髮會反射大量太陽輻射，但這種毛髮也會將一些入射輻射散射到皮膚，在那裡它被吸收為熱量。相比之下，深色皮毛在其外表面吸收太陽輻射，風會迅速消散其提供的熱量。
在成功重建猛獁象的遠古核基因後，霍夫萊特小組將注意力轉向尼安德特人，尼安德特人是 智人 的近親，生活在歐亞大陸，大約在 28,000 年前滅絕。該團隊獲得了 MC1R 基因的 128 個核苷酸片段，該片段編碼了今天人類中未見的氨基酸取代。與猛獁象等位基因一樣，功能分析表明，這種單一變化使蛋白質的活性低於標準人類版本。鑑於功能相似降低的 MC1R 基因變體出現在現代歐洲血統的人類中，他們有紅頭髮和白皙的皮膚，我們推測一些尼安德特人也可能擁有紅頭髮和白皙的皮膚（儘管是由於蛋白質活性具有相似影響的不同突變）。在尼安德特人居住的高緯度地區，合成維生素 D 所需的紫外線供應不足。淺色可能有助於尼安德特人吸收足夠的紫外線，紫外線不太容易穿透深色皮膚。
這些開創性的研究明確地表明，可觀察性狀的基因重建現在已經成為現實。我們現在準備使用這種強大的新工具來追蹤已滅絕物種的生命過程——真正的古生理學。
當血液變冷時
今天，所有適應寒冷的大型哺乳動物——從馴鹿到麝牛——都擁有一套緊密排列的動脈和靜脈系統，這些動脈和靜脈沿著四肢和末端彼此反向平行地延伸。這種排列被稱為 rete mirabile，或“奇妙的網路”，形成了一種高效的逆流熱交換器，其中離開身體核心的溫暖、含氧動脈血將其大部分熱量傳遞給流向心臟的寒冷靜脈血。由此產生的溫差使與寒冷表面（如腳墊）接觸的末端溫度保持在略高於冰點的水平，從而大大減少了整體熱量損失。這些熱量節省意味著保持溫暖所需的卡路里更少，從而在冬季為北極物種提供了至關重要的優勢，因為冬季通常很難獲得卡路里。矛盾的是，這種解剖學適應性剝奪了末端確保血紅蛋白正常運作所需的熱能。在脊椎動物中，紅細胞蛋白血紅蛋白從肺部收集氧氣，然後將其輸送到組織。然而，打破血紅蛋白和氧氣之間微弱的化學鍵需要能量，因此血紅蛋白向組織輸送氧氣的能力會隨著溫度的下降而驟降。
為了彌補這一缺點，耐寒哺乳動物的血紅蛋白需要補充熱源。儘管人們對這種性狀背後的精確分子機制尚不清楚，但它們通常似乎涉及血液細胞內部的其他分子與血紅蛋白的結合。這些分子與血紅蛋白之間化學鍵的形成釋放出熱能，這些熱能可以捐獻出來幫助血紅蛋白將氧氣釋放到組織中。
坎貝爾的團隊——直到那時還獨立於霍夫萊特團隊工作——假設猛獁象血紅蛋白也進化出了有助於在寒冷中釋放氧氣的變化。對猛獁象血紅蛋白基因進行測序，並將這些序列與亞洲象血紅蛋白基因的序列進行比較，大概可以揭示是否發生了這種變化以及它們是什麼。
早期與澳大利亞阿德萊德大學的艾倫·庫珀合作對產生形成血紅蛋白骨架的不同所謂珠蛋白鏈蛋白的兩個猛獁象基因進行測序的嘗試遇到了重大挫折：大多數可用的猛獁象樣本質量都不夠高，無法獲得可用的 DNA 片段。在這一點上，坎貝爾和庫珀的團隊與霍夫萊特的團隊聯手，並使用參與 MC1R 研究的相同 DNA 提取物，我們很快獲得了兩個猛獁象血紅蛋白基因的完整編碼序列，從而瞭解了珠蛋白鏈的氨基酸序列。
最初的 DNA 測序結果顯示，猛獁象珠蛋白鏈之一與亞洲象在 146 個氨基酸位置中的 3 個位置不同——這一發現很快成為令人興奮的來源，因為我們確信這三個氨基酸取代包含了適應寒冷的生理學的清晰遺傳特徵。對這一假設的初步支援來自一種罕見的人類血紅蛋白變體，稱為 Rush 血紅蛋白，它攜帶猛獁象序列中發現的突變之一。儘管 Rush 蛋白僅在一個氨基酸位置上與正常人血蛋白不同，但這種差異從根本上改變了血紅蛋白的生化特性，從而顯著降低了其溫度敏感性，因此使其能夠在寒冷中更輕鬆地釋放氧氣，就像適應寒冷的哺乳動物的血紅蛋白一樣。
建立猛獁象血紅蛋白中明顯的變化是對寒冷氣候的適應的下一步是復活遠古血紅蛋白並觀察其作用。為了複製猛獁象血紅蛋白組分的基因，我們從亞洲象血液中獲得了完整的血紅蛋白基因，並在三個突變位點對其進行了改造，以匹配猛獁象序列。然後，我們將產生的類似猛獁象的基因插入大腸桿菌細菌中，欺騙它們組裝出與曾經在提供 DNA 的 43,000 年曆史的標本血液中迴圈的猛獁象血紅蛋白在形式和功能上無法區分的猛獁象血紅蛋白。
歷史上，我們第一次能夠以與研究現代動物的生理過程完全相同的方式分析已滅絕物種的重要生理過程。我們仔細測量了猛獁象和亞洲象血紅蛋白在模擬紅細胞內部化學環境的溶液中在各種生理相關溫度下結合和釋放氧氣的能力。正如 Rush 血紅蛋白研究預測的那樣，猛獁象蛋白質在寒冷溫度下確實比亞洲象血紅蛋白更容易釋放氧氣（兩種血紅蛋白在 37 攝氏度左右的正常核心體溫下功能相同）。有趣的是，猛獁象血紅蛋白結合其他分子並因此產生輸送其氧氣有效載荷所需的補充熱源的能力，是由與現代北極哺乳動物血紅蛋白中發現的完全不同的遺傳變化引起的，正如猛獁象血紅蛋白基因序列與現代對應物的序列比較所示。值得一提的是，雖然猛獁象突變是適應耐寒性的，但人類 Rush 變體並非如此，因為它會破壞蛋白質的穩定性，從而使攜帶者長期貧血。為什麼這種不良特性會出現在人類血紅蛋白中，而不是猛獁象血紅蛋白中，這個問題仍然需要解答。
飼養猛獁象？
當然，血紅蛋白適應性只是猛獁象如何適應寒冷生活的一個難題；這些動物的許多其他生化適應性，更不用說其他數十種已滅絕物種的生化適應性，仍有待闡明。不幸的是，科學家近年來測序的大量遠古基因組不太可能在這方面提供太多幫助，因為用於獲得它們的所謂鳥槍法測序技術產生了一系列隨機序列，這些序列雖然對於宏觀評估很有用，但通常不夠準確或完整，無法提供生理學見解，除非測序重複多次以至於成本相對過高。
一種稱為雜交捕獲的新方法以更低的成本生成目標基因的更深覆蓋率，因此可以解決該問題，從而可以進行大規模研究，比較例如來自相對溫暖的間冰期的西伯利亞猛獁象與來自冰川最厚時期的寒冷冰期最大期的重要基因網路。雜交捕獲還可以使研究人員能夠比較同一物種的地理位置分散的種群——例如西伯利亞和西班牙猛獁象。此類研究不僅可以評估物種內的遺傳變異性，還可以深入瞭解針對當地地理和氣候條件的新型生理適應性。儘管這些未來前景令人興奮（想象一下 50,000 年的進化在你眼前展開），但我們分析古生理學的能力在某種程度上受到限制。理想情況下，我們會在體內研究已滅絕的蛋白質，因為蛋白質的許多特性只有在活生物體中才能顯現出來。然而，此類研究不太可能很快發生，因為它們需要重建已滅絕的物種。
目前，我們將不得不滿足於在試管和細胞培養物中觀察遠古蛋白質。我們已經在使用這些技術來探索其他已消失生物的生理學——其中包括乳齒象和一種最近滅絕的北極海洋哺乳動物，即斯特拉海牛。克隆這些動物的極其複雜的可能性在可預見的未來仍將停留在幻想領域。與此同時，我們將繼續一次呼吸一口遠古蛋白質，為這些早已死去的野獸注入生命。